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原代细胞培养:新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养并检测相关蛋白与基因案例介绍

第一部分 实验设计

一、细胞:分离大鼠原代心房肌细胞
二、细胞培养分组:
    a)对照组:正常大鼠原代心房肌细胞72h培养
    b)高糖72h培养
    c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养
    d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h
    e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h
    f)正常培养48h+(氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子)共同培养24h
三、蛋白检测:WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。
四、荧光定量检测:荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。


第二部分 实验操作、结果及报告

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养:
    1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小;
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化
后4℃放置;
    3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
    5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;


二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定:
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;
    2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
    3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗(Abbioscience公司),然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
    5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗(嘉美生物公司), 37℃条件下放置1h;
    6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。
 

200×

400×


三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达水平
1、总RNA的提取:
   (1)将细胞培养液吸出后,用PBS洗细胞2次,加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min,用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中,上下轻柔颠倒10次,室温静置5min;
   (2)加0.2 mL氯仿,颠倒混匀10次,室温静置5min,4℃,12000rpm,离心20min;
   (3)转上层水相于另一新EP管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀10次,-20℃放置2h后,4℃,12000rpm,离心15min;
   (4)用移液器小心吸弃上清,加冰预冷的75%乙醇,4℃,12000rpm,离心10min;
   (5)弃上清,EP管倒扣,空气干燥10 min;
   (6)将总RNA溶于适量DEPC处理水中,最后用分光光度计测量其浓度。
2、第一链cDNA合成(Genecopoeia试剂盒)
   (1)反应体系(20μL):
    Total RNA  2μg
    Oligo (dT)18  1μL
    10mM dNTPs  1μL
    5×RT Buffer  4μL
    Ribonuclease Inhibitor  0.5μL
    TransScript RT  1μL
    ddH2O to final volume  20μL   

   (2)轻轻混匀后,进行:
    a) 42℃孵育30min.
    b) 85℃孵育5min.
    c) -20℃,保存备用.
3、Real-time PCR(Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒)
  (1)引物序列:
    a、CaMK-ⅡδF:CTGGCACACCTGGGTATCTT
       CaMK-ⅡδR:ATCCCAGAAGGGTGGGTATC
    b、A Gene F:TAACCTACCAGGCCGTGGAT
       A Gene R:GCTGCGATCTGGATAAGTTCAA
    c、B Gene F:GCAGTTGACTGAGGCGTCTT
       B Gene R:GGATTCGTGAGTGGCGATAC
    d、FKBP12.6 F:CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAG
       FKBP12.6 R:GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTC
    e、β-actin F:GACGGTCAGGTCATCACTATCG
       β-actin R:ACGGATGTCAACGTCACACTTC
   (2)反应体系(25μL):
    F引物  0.5μL
    R引物  0.5μL
    SuperMix  12.5μL
    Passive Reference Dye  0.5μL
    cDNA  2μL
    ddH2O  9μL
   (3)程序设置如下(Eppendorf PCR仪):
    95℃       3min
    95℃       20s
    55℃       20s          40循环
    72℃       20s
    95℃       15s
    60℃       15s
    60℃-95℃  20min
    95℃       15s
   (4)Realplex软件导出数据并分析

CAMK-II基因

A基因

B基因

FKBP 12.6基因


四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平
1、实验材料

    PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒(嘉美生物)、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉,CaMK-Ⅱδ一抗(Abbioscience)、B蛋白一抗(Abbioscience)、FKBP12.6一抗(Abbioscience)、β-actin一抗
(Abbioscience)和B蛋白一抗 (Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECL Reagent(嘉美生物)、显影剂、定影剂。
2、实验仪器
    细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。
3、实验方法
   (1)细胞裂解液配制:基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。
   (2)蛋白样品制备:
        ①弃去六孔板细胞中的培养基。
        ②每孔细胞中加入2mL 4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动2min洗涤细胞,然后弃去PBS洗液。重复以上操作。
        ③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解,然后用细胞刮将细胞刮下,最后将裂解液移入干净的EP管中。
        ④将EP管中细胞冰上裂解30min,在此期间用1mL 注射器对裂解液进行反复抽吸20次。
        ⑤裂解完后,于4℃,12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mL EP管中,即为所需蛋白样品。
        ⑥每样本取3μL  蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液,沸水煮5min,最后将其-80℃保存。
   (3)蛋白浓度测定:
         根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下:
        ①将0.5μg/μL 蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中,然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。
        ②每样品加2μL 到96孔板的样品孔中,然后将各孔补加18μL 的细胞裂解液。
        ③各孔加人200μL BCA工作液(BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1),37℃条件下放置30min。
        ④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结果见后面结果部分内容。
   (4)SDS-PAGE电泳:
        ①配胶:CaMK-Ⅱδ(1.5mm 10%分离胶, 5%浓缩胶)、A蛋白、B蛋白(1.5mm 5%分离胶,4%浓缩胶)、FKBP12.6(1.5mm 15%分离胶,5%浓缩胶)
        ②上样:取制备好的蛋白样品,使用前沸水煮5min,12000rpm离心2min。各样本之间平衡后,每泳道上样45μL。
        ③电泳:浓缩胶60V,分离胶100V,溴酚蓝移动至玻璃板底端,提示电泳结束,关闭电源。
   (5)转膜:
        ①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min,然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。
        ②将转膜夹打开,在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫,再添加2层湿润的滤纸,将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方,表面再覆盖大小合适的PVDF膜;然后再覆盖两层湿润
滤纸,再垫上湿润的海绵垫,最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好,将其放入转膜槽中相应的位置。
        ③转膜CaMK-Ⅱδ(100V,60min);A蛋白、B蛋白(100V,180min);FKBP12.6(80V,30min),转膜全过程在冰上进行。
        ④丽春红染色:转膜完成后,将膜从转膜夹中取出,立即投入丽春红染液中染色,大约染色3min 后将膜从丽春红染液中取出,用DDH2O轻轻冲洗膜,注意观察膜上的红色条带,当条带足够清
晰后停止水洗,根据蛋白Marker位置适当剪膜,留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O彻底洗膜,尽可能洗去残留的丽春红染料。
   (6)封闭:室温条件下,5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。
   (7)一抗杂交:
        CaMK-Ⅱδ(1:500)、A蛋白(1:200)、B蛋白(1:50)、FKBP12.6(1:300)、β-actin(1:1000),4℃孵育过夜。
   (8)洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
   (9)二抗杂交:山羊抗兔-HRP二抗(1:2500),室温孵育1h。
   (10)洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
   (11)显影:
         首先,用滤纸吸去膜上的液体,将膜平放于保鲜膜上,将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到膜面上,反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent,然后根据条带的亮度将膜放到
压片夹中曝光适当的时间,最后,显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。


BCA试剂盒蛋白定量实验结果:
标准品OD值分别为:
0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884
LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为:0.646、0.677、0.671、0.698
ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为:0.816、0.703、0.79、0.612

 

WB实验结果:

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