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荧光定量PCR实验案例介绍

实验分组:A 正常组;B 阴性对照组;C XXXX-1转染组;D XXXX-2转染组;E XXXX-3转染组

第一个筛选实验:荧光定量PCR实验
实验分组:           

NO

样本编号

1

A

2

B

3

C

4

D

5

E

 

 

 

 




实验试剂:Trizol, Invitrogen ,#15596-026;RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631;Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521;RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381;SYBR GreenPCR Master Mix,ABI 4309155;Realtime-PCR仪,ABI 7900型;引物由primer3.0软件设计,并由嘉美生物合成。步骤(略)。

结果数据:Ct(基本循环数);ΔCt(基本循环与内参循环数差值);ΔΔCt*(最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值);2-ΔΔCt(RQ) :目的基因mRNA相对含量(* 相对定量以含量最低的样本为标准,其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth,et al. (2001) METHODS 25, 402–408)。

扩增曲线:在实时荧光PCR扩增反应中,荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段:基线期,指数期初期,指数期,平台期,在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线,阴性对照(模板为水)无显著荧光信号,提示荧光定量PCR反应程序正常运行,目的基因得到有效扩增,实验操作规范,试剂符合实验要求。

熔点曲线:从软件中显示形状只有一个峰值,没有出现杂峰,提示无非特异性荧光信号,目的基因扩增产物单一,有利于结果分析。

 

Sample

CT

ΔCт

ΔΔCт

RQ

RQ mean

SD

1

26.1312

5.7691

-2.2238

4.6712

4.4587

0.6585

1

26.3320

6.0975

-1.8954

3.7203

 

 

1

26.0145

5.6754

-2.3175

4.9847

 

 

2

27.0101

5.9786

-2.0143

4.0398

3.9841

0.0485

2

27.0077

6.0073

-1.9856

3.9603

 

 

2

27.0584

6.0103

-1.9826

3.9520

 

 

3

28.1032

8.3378

0.3449

0.7874

0.5186

0.2327

3

28.7212

9.3670

1.3741

0.3858

 

 

3

28.5034

9.3785

1.3856

0.3827

 

 

4

28.0210

7.8063

-0.1866

1.1381

1.3224

0.2119

4

28.0042

7.6421

-0.3508

1.2753

 

 

4

27.9142

7.3570

-0.6359

1.5539

 

 

5

26.3742

7.0578

-0.9351

1.9120

2.1770

0.3723

5

26.5004

6.6129

-1.3800

2.6027

 

 

5

26.6316

6.9812

-1.0117

2.0163

 

 

1-内参

20.3621

 

1-内参

20.2345

 

1-内参

20.3391

 

2-内参

21.0315

 

2-内参

21.0004

 

2-内参

21.0481

 

3-内参

19.7654

 

3-内参

19.3542

 

3-内参

19.1249

 

4-内参

20.2147

 

4-内参

20.3621

 

4-内参

20.5572

 

5-内参

19.3164

 

5-内参

19.8875

 

5-内参

19.6504

 

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