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逆转录PCR(RT-PCR)实验案例介绍

实验材料:细胞样品4份,分组编号(见图片标示)
试剂:Trizol Reagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTra Ace-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1% DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇;AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备;1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器:PCR仪,ABI9600;电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型;高速离心机,湘仪H1650-W; 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751);成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料:
Homo- XXXX-F    5- cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo- XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F   5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R   5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段长度   450bp
实验步骤:
1、RNA提取:
每样本加入1ml Trizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎,细胞约106—107);匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿,震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min;将水样层转移至干净的试管,加入0.5倍体积的异丙醇,混匀后-20℃下静置10-15min,在2~8℃下12,000×g离心10min;移去上层悬液,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤,在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min,弃去上清液;适度干燥RNA沉淀后,加入适量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量:紫外分光光度计开机预热30 min;用蒸馏水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入DEPC水后,放入样品室的S池架上,关上盖板;设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零);将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后,记录编号和稀释度;把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板;分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为最佳);用蒸馏水洗涤石英比色皿,酒精浸泡。
3、实验结果判断:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
样本编号 稀释倍数 A260 A280 A260/A280 RNA浓度(ug/ul)
YYYY 250 0.348 0.179 1.944 3.48
AAAA 250 0.289 0.151 1.914 2.89
BBBB 250 0.302 0.159 1.899 3.02
CCCC 250 0.333 0.171 1.947 3.33
计算A260/ A280比值,比值≥1.8,满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤:
产物用琼脂糖凝胶电泳检测:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。


点样说明及IOD参考值分析:
泳道 1 2 3 4
样品 YYYY AAAA BBBB CCCC
XXXX基因 15930 8099 10591 12963
R 0.603 0.325 0.438 0.545
泳道 5 6 7 8
样品 YYYY AAAA BBBB CCCC
GAPDH 26431 24934 24206 23786
R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。
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