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RNA干扰案例:YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验

第一部分:实验细胞筛选
一、免疫荧光实验

实验试剂 :PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4),非免疫山羊血清,Triton X-100,BSA抗体稀释液,XXXX蛋白一抗 (1:100),二抗Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光(IF)染色:倒出细胞培养液,PBS冲洗三次;2-4%甲醛固定15分钟;1×PBS缓冲液(0.01 M,pH7.4)洗涤3次,每次5分钟;滴加非免疫山羊血清(内含0.3%Triton X-100)封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min,甩去多余液体;滴加一抗plscr1 50μL(1:100),4℃过夜;PBS洗3次,每次5分钟;滴加荧光标记的上述二抗50μL(1:200),室温 60分钟;PBS洗3次各5min;荧光显微镜下观察、拍照,每指标照相2套图像。
IF染色结果(400倍):通过荧光染色可以分析出,XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最突出。
YYYY细胞 

 

AAAA细胞

 

BBBB细胞 

    

CCCC细胞

  

 

二、RT-PCR实验

实验材料:细胞样品4份,分组编号(见图片标示)
试剂:Trizol Reagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTra Ace-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1% DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇;AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备;1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器:PCR仪,ABI9600;电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型;高速离心机,湘仪H1650-W; 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751);成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料:

Homo- XXXX-F    5- cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo- XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F   5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R   5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段长度   450bp

实验步骤:
1、RNA提取:
每样本加入1ml Trizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎,细胞约106—107);匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿,震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min;将水样层转移至干净的试管,加入0.5倍体积的异丙醇,混匀后-20℃下静置10-15min,在2~8℃下12,000×g离心10min;移去上层悬液,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤,在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min,弃去上清液;适度干燥RNA沉淀后,加入适量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量:紫外分光光度计开机预热30 min;用蒸馏水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入DEPC水后,放入样品室的S池架上,关上盖板;设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零);将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后,记录编号和稀释度;把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板;分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为最佳);用蒸馏水洗涤石英比色皿,酒精浸泡。
3、实验结果判断:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)

 

样本编号

稀释倍数

A260

A280

A260/A280

RNA浓度(ug/ul)

YYYY

250

0.348

0.179

1.944

3.48

AAAA

250

0.289

0.151

1.914

2.89

BBBB

250

0.302

0.159

1.899

3.02

CCCC

250

0.333

0.171

1.947

3.33

计算A260/ A280比值,比值≥1.8,满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤:
产物用琼脂糖凝胶电泳检测:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。


 

点样说明及IOD参考值分析:

 

泳道

1

2

3

4

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX基因

15930

8099

10591

12963

R

0.603

0.325

0.438

0.545

泳道

5

6

7

8

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

GAPDH

26431

24934

24206

23786

R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。


三、WB实验

实验试剂:XXXX蛋白多抗 (1:400),37Ka;GAPDH单抗(1:1000),37Ka;Rabbit Anti Goat IgG/HRP(1:30,000);Goat Anti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程:
实验结果:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。


 

 

 

Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

131.69

51.667

65.03

97.148

GAPDH

283.05

282.52

290.29

289.44

样本

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最高。
通过上述实验,确定有YYYY细胞来进行XXXX基因沉默实验最具意义。


第二部分:细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养

使用10%胎牛 DMEM培养液,37℃ 下置于5%CO2培养箱中。待细胞融合至80%,用0.25%胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板,待细胞融合至约70%后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照
YYYY细胞图片如下:

 

1)细胞培养方法:略


二、细胞转染

材料:YYYY细胞;XXXX基因siRNA(20Μm, 合成);Lipofectamine? 2000试剂(使用前贮存在+4℃);Opti-MEM I 低血清培养基(使用前37℃预热);6孔组织培养板
转染步骤:使用Lipofectamine? 2000转染siRNA。转染前一天,4-5×104细胞接种在6孔板上,2mL含FBS的基础培养基;选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70%;按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine? 2000复合物:a.以250ul Opti-MEM? I稀释5ul Lipofectamine? 2000,轻轻混匀,室温下孵育5分钟。b.以250ul Opti-MEM? I稀释250pmol siRNA,轻轻混匀。c.孵育5分钟后,混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine? 2000,轻轻混合,在室温下孵育20分钟,以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊,但是这不会影响转染;将siRNA - LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合;6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率;37℃,CO2培养箱孵育48小时,进行WB,real-time检测。
转染效率检测: 

 

                         荧光镜下视野            光镜下视野
通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知,细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。


三、siRNA最佳浓度筛选

实验分组:A 正常组;B 阴性对照组;C XXXX-1转染组;D XXXX-2转染组;E XXXX-3转染组
第一个筛选实验:荧光定量PCR实验
实验分组:           

NO

样本编号

1

A

2

B

3

C

4

D

5

E

 

 

 

 




实验试剂:Trizol, Invitrogen ,#15596-026;RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631;Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521;RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381;SYBR GreenPCR Master Mix,ABI 4309155;Realtime-PCR仪,ABI 7900型;引物由primer3.0软件设计,并由嘉美生物合成。步骤(略)。
结果数据:Ct(基本循环数);ΔCt(基本循环与内参循环数差值);ΔΔCt*(最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值);2-ΔΔCt(RQ) :目的基因mRNA相对含量(* 相对定量以含量最低的样本为标准,其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth,et al. (2001) METHODS 25, 402–408)。
扩增曲线:在实时荧光PCR扩增反应中,荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段:基线期,指数期初期,指数期,平台期,在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线,阴性对照(模板为水)无显著荧光信号,提示荧光定量PCR反应程序正常运行,目的基因得到有效扩增,实验操作规范,试剂符合实验要求。

熔点曲线:从软件中显示形状只有一个峰值,没有出现杂峰,提示无非特异性荧光信号,目的基因扩增产物单一,有利于结果分析。

 

Sample

CT

ΔCт

ΔΔCт

RQ

RQ mean

SD

1

26.1312

5.7691

-2.2238

4.6712

4.4587

0.6585

1

26.3320

6.0975

-1.8954

3.7203

 

 

1

26.0145

5.6754

-2.3175

4.9847

 

 

2

27.0101

5.9786

-2.0143

4.0398

3.9841

0.0485

2

27.0077

6.0073

-1.9856

3.9603

 

 

2

27.0584

6.0103

-1.9826

3.9520

 

 

3

28.1032

8.3378

0.3449

0.7874

0.5186

0.2327

3

28.7212

9.3670

1.3741

0.3858

 

 

3

28.5034

9.3785

1.3856

0.3827

 

 

4

28.0210

7.8063

-0.1866

1.1381

1.3224

0.2119

4

28.0042

7.6421

-0.3508

1.2753

 

 

4

27.9142

7.3570

-0.6359

1.5539

 

 

5

26.3742

7.0578

-0.9351

1.9120

2.1770

0.3723

5

26.5004

6.6129

-1.3800

2.6027

 

 

5

26.6316

6.9812

-1.0117

2.0163

 

 

1-内参

20.3621

 

1-内参

20.2345

 

1-内参

20.3391

 

2-内参

21.0315

 

2-内参

21.0004

 

2-内参

21.0481

 

3-内参

19.7654

 

3-内参

19.3542

 

3-内参

19.1249

 

4-内参

20.2147

 

4-内参

20.3621

 

4-内参

20.5572

 

5-内参

19.3164

 

5-内参

19.8875

 

5-内参

19.6504

 


第二个筛选实验:WB实验
实验试剂:

WB实验操作流程:
实验结果:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。

 

Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Lane  5

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

216.21

200.86

60.691

124.52

166.52

GAPDH

299.62

295.32

293.13

307.85

312.45

样本

A

B

C

D

E

以上实验得出XXXX-1干预效果最好,可选择做后续实验。


第三部分:细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验

实验分组:A  正常细胞培养组;B  XXXX-1干预组


一、MTT方法检测细胞毒性

原理:MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶,可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞(Formazan),死细胞此酶消失,MTT不被还原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤:在96孔板加入细胞100μL/孔(约1×104),置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时;加入适当浓度的受试化合物;将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间;将5×MTT用 Dilution Buffer稀释成1× MTT;每孔加50μL 1× MTT,在37℃孵育4小时,使MTT还原为甲月赞;吸出上清液,每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解,用平板摇床摇匀;酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析:细胞存活率% =(加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD)×100%。注:本底OD值(完全培养基加MTT,无细胞)
0h 570nm波长各孔OD值:

 

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.457

0.452

0.463

0.457

B

0.461

0.448

0.454

0.454

 本底

0.007

0.009

0.010

0.009

12h 570nm波长各孔OD值:

 

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.503

0.518

0.511

0.511

B

0.494

0.501

0.489

0.495

 本底

0.009

0.012

0.011

0.011

24h 570nm波长各孔OD值:

 

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.618

0.607

0.624

0.616

B

0.573

0.566

0.584

0.574

 本底

0.007

0.008

0.008

0.008

48h 570nm波长各孔OD值:

 

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.744

0.765

0.738

0.749

B

0.636

0.663

0.657

0.652

 本底

0.009

0.008

0.008

0.008

72h 570nm波长各孔OD值:

 

实验分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.821

0.817

0.834

0.824

B

0.701

0.724

0.695

0.707

 本底

0.013

0.008

0.009

0.010

 

 

二、细胞粘附能力实验

试剂耗材及仪器设备:结晶紫染色液;1×PBS, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》;仪器:美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml,以每孔100μl分别包被96孔板;37℃包被2h,用1×PBS洗涤2次,再用1% BSA封闭2h。;将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液,每个样本计数3次取平均数,调节细胞浓度为3×105个/ml,以每孔200μl加入包被好的培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中孵育2h;取出96孔板,轻轻洗去未粘附的细胞,每孔用100μl 4%中性甲醛固定,30分钟后洗去;每孔加100μl 0.5%结晶紫,室温染色2h,,蒸馏水洗涤一次,阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液,放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。

检测结果:
0h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.586

0.563

0.592

0.580

B

0.575

0.580

0.577

0.577

Fn OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.649

0.633

0.654

0.645

B

0.627

0.641

0.638

0.635

12h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.594

0.584

0.571

0.583

B

0.546

0.543

0.558

0.549

Fn OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.656

0.639

0.643

0.646

B

0.609

0.611

0.603

0.608

24h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.602

0.591

0.603

0.599

B

0.511

0.508

0.502

0.507

Fn OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.671

0.665

0.653

0.663

B

0.563

0.574

0.585

0.574

48h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.575

0.582

0.586

0.581

B

0.474

0.463

0.481

0.473

Fn OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.648

0.659

0.661

0.656

B

0.521

0.516

0.534

0.524

72h  570nm波长各孔OD值:
Ln OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.569

0.573

0.568

0.570

B

0.392

0.407

0.384

0.394

Fn OD值

 

分组

样品

平行样品

平行样品

平均值

A

0.636

0.641

0.652

0.643

B

0.489

0.476

0.486

0.484

 

三、细胞侵袭实验

实验材料:Corning公司:Transwell 6孔板,孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl,置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液,培养细胞。
结果统计:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A  


平均107个细胞


平均66个细胞


平均98个细胞


平均54个细胞
 


平均103个细胞


平均61个细胞


四、细胞迁移实验

材料:Corning公司:Transwell 6孔板,孔径8um.
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基;取细胞悬2ml加入Transwell小室;培养细胞:常规培养24h。
结果统计:用棉签擦去上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A  


平均119个细胞


平均54个细胞
A  


平均115个细胞


平均52个细胞
A  


平均121个细胞


平均43个细胞
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