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免疫沉淀实验服务案例介绍:小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测

一、实验分组:小鼠XX细胞,按下面分组进行药物干预培养,并收集细胞进行免疫沉淀实验。
1 正常对照组
2 高糖组
3 高糖+E药物
4 高糖+A药物(25μM)
5 高糖+A药物(50μM)
6 高糖+A药物(100μM)
7 高糖+A药物(100μM)+B药物(1mM)
8 高糖+C药物(25μM)
9 高糖+C药物(50μM)
10 高糖+C药物(100μM)
11 高糖+C药物(100μM)+B药物(1mM)
12 高糖+D药物(25μM)
13 高糖+D药物(50μM)
14 高糖+D药物(100μM)
15 高糖+D药物(100μM)+B药物(1mM)

二、免疫沉淀过程
1、实验试剂:A抗体(santa cruz,IP浓度 1:100);B抗体(santa cruz,IP浓度 1:100);Protein A+G Agarose(嘉美生物)
2、蛋白样品的准备:1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注意事项:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。 
3、去除非特异性结合:1).取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。 
4、免疫沉淀:采用A蛋白抗体,B蛋白抗体沉淀蛋白。1).加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。 2).再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3).2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4).用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5).完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。 6).100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。

三、Western blot检测
1、实验试剂:Phosphotyrosine抗体( Millipore, #05-321, 1:500);Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP(ZYMED, #62-64201,1:40,000-100,000)
2、实验设备:① 电泳电源:Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323);② 电泳仪及附件:Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301);③ 电转仪及附件:Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930);④ NC膜:PIERCE,Catalog#88018;⑤ 滤纸:Whatman,3MM CHR
3、实验步骤:
4、实验结果:目的蛋白检测,取以上沉淀下来蛋白混合液处理后,每孔点样15ul。

注:SDS-PAGE凝胶浓度为12%;阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其(integrated optical density)累积光密度参考值。(例如:1.33E+05=1.33×105)。

Lanes: Lane  1 Lane  2 Lane  3 Lane  4 Lane  5 Lane  6 Lane  7
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
p-A蛋白 19.415 79.179 81.869 64.923 64.544 38.742 76.364
样本NO 1 2 3 4 5 6 7
 
Lanes: Lane  1 Lane  2 Lane  3 Lane  4 Lane  5 Lane  6 Lane  7 Lane  8
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
p- A蛋白 66.048 38.485 24.444 41.068 50.312 57.092 42.603 94.83
样本NO 8 9 10 11 12 13 14 15

Lanes: Lane  1 Lane  2 Lane  3 Lane  4 Lane  5 Lane  6 Lane  7
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
p- B蛋白 19.37 61.188 56.7 47.383 42.308 16.953 75.589
样本NO 1 2 3 4 5 6 7
 
Lanes: Lane  1 Lane  2 Lane  3 Lane  4 Lane  5 Lane  6 Lane  7 Lane  8
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
p- B蛋白 70.891 38.042 43.421 29.656 64.184 25.98 41.653 77.76
样本NO 8 9 10 11 12 13 14 15
 
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