Hi,欢迎来到嘉美实验中心
公司文化|联系我们

lab-manager@jiamay.com400-000-7401

(扫一扫关注我们)

联系我们

电 话:400-000-7401

邮 箱:lab-manager@jiamay.com

地 址:北京市昌平区中东路5号院4号楼1809

邮 编:100012

您当前所在的位置:首页 > 实验案例 > 免疫生化案列 >

实验案例介绍:明胶酶谱MMP活性检测

实验仪器  泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323);电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
 
实验标本  大鼠心脏组织20个
 
实验试剂
1、凝胶试剂:30%丙烯酰胺溶液;Tris-Base(SIGMA);10%SDS(SIGMA);10%过硫酸铵;TEMED(sigma)
2、常用溶液及缓冲液:制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶:采用8%分离胶。将20Xsubstrater融化,并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍,混匀,然后再加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。
A.5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml:
ddH2O:1.575ml
30%丙烯酰胺溶液: 0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8): 0.315ml
10%SDS: 25ul
20Xsubstrate:125ul
10%过硫酸铵:25ul
TEMED:3ul
B.8%分离胶溶液
按总体积10ml:
ddH2O:4.1ml
30%丙烯酰胺溶液:2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8):2.5ml
10%SDS:100ul
20Xsubstrate:500ul
10%过硫酸铵:100ul
TEMED: 6ul
C.电泳缓冲液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS,加蒸馏水至IL,pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液,在室温下长期保存。
 
检测步骤
A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 阳性对照:取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1:1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer,混合后直接上样。不加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min,溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶,去除压缩胶。放入容器中,先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A,室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B,室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后,再采用脱色液(甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %)进行脱色60min。
F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描,显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2,92 kDa为MMP-9。
试剂盒组成与储存
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃ 
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃
 
实验结果
注:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。(例如:1.33E+05=1.33×105)。   P: positive mixture   每孔点样蛋白约10ug

Lanes: Lane1 Lane2 Lane3 Lane4 Lane5 Lane6 Lane7 Lane8 Lane9 LaneP
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
MMP-9 16200 20200 26700 33200 30474 43300 38600 35131 23500 60323
MMP-2 12535 101884 12974 12322.6 12170.2 11685 12481 9677.5 12522 16578
样本 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P

Lanes: Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 Lane 5 Lane 6 Lane 7 Lane 8 Lane 9 Lane P
Rows (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD) (IOD)
MMP-9 25390 25500 44900 42000 60300 43400 43100 36600 33400 67703
MMP-2 10120 12053 13797 15995 15138 13139 15800 12447 12514 14632
样本 10 11 12 13 14 15 16 17 18 P

Lanes: Lane 1 Lane 2 Lane P
Rows (IOD) (IOD) (IOD)
MMP-9 29000 66424 66935
MMP-2 3164.7 9350.6 13975
样本 19 20 P
相关文章
© 2017 北京嘉美臻元生物技术有限公司 保留所有权利 京ICP备10216606号-3