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Chip实验:证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合

一、实验背景
在IL-6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP-DNA复合物,以Tmub1基因的碱基序列设计引物,以提取的DNA为底物,进行扩增,从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因,进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

二、实验分组
分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测(检测Tmub1蛋白表达水平,抗体嘉美实验中心提供。注:嘉美实验中心提供绝大多数常用国外原装进口抗体,为实验委托者节约大量实验经费。)
第一组:A组
第二组:B组

三、实验步骤
转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测
实验对照:设定的对照有
1、阳性对照(系统阳性对照,Anti-RNA Polymerase II)
2、INPUT对照(DNA片段在沉淀以前,收集下来的对照)
3、阴性对照(非免疫IgG血清吸附,Normal Mouse IgG)
细胞转染流程:略
 
     EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程(Millipore Catalog # 17-371)

一、试剂盒描述
试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体

二、试剂盒组分
1、试剂盒含有成分
  1) Store at 4℃:
    ChIP Blocked Protein G Agarose,1.5 ml
    ChIP Dilution Buffer, One vial containing,24 ml
    Low Salt Immune Complex Wash Buffer,24 ml
    High Salt Immune Complex Wash Buffer,24 ml
    LiCl Immune Complex Wash Buffer,24 ml
    TE Buffer,24 ml
    0.5 M EDTA,250 ul
    5 M NaCl,500 ul
    SDS Lysis Buffer,10 ml
    1 M Tris-HCl, pH 6.5,500 ul
    10X Glycine,11 ml
    10X PBS,24 ml       
  2) Store at -20℃:
    Protease Inhibitor Cocktail II(蛋白酶抑制剂),2×110 ul
    RNase A,600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.
    Proteinase K,600 ug of Proteinase K in 60 ul 
    1M NaHCO3,600 ul
    Anti-RNA Polymerase II ,25ug  clone CTD4H8.
    Normal rat IgG
  3)Store at Room Temperature:
    20% SDS,242 ul of 20% SDS.
    Spin Filters,One bag containing 22 Spin Filters with Collection Tubes
    Collection Tubes,22 Collection Tubes.
    Bind Reagent A ,25 ml of Bind Reagent A.
    Wash Reagent B,12.5 ml of Wash Reagent B.
    Elution Reagent C,1.5 ml of Elution Reagent C.
2、抗体及血清
  特异性抗体:Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美实验提供)
  Normal rat IgG

三、 仪器设备
  微量混匀器Vortex mixer,
  震摇器Rotating wheel/platform.
  计时器Timer,
  可调微量加样枪以及tip头,Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips
  高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,
  细胞刮子Cell scraper,Sonicator,
  1.5 Ml离心管Microfuge tubes,
  PCR管PCR tubes,
  引物设计:略
         
四、CHIP 操作流程
1、细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解
  预先准备:
  1) 准备细胞,150 mm培养瓶(20ml培养液)密度为80-90%,细胞数量≥1 x 10-7个;
  2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷;
  3) 取出SDS Lysis Buffer,放置至常温确保SDS溶解不析出;
  4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
  正式步骤:
  1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛,室温孵育10min;
  2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine(甘氨酸)混匀,室温放置5min,以中和甲醛反应;
  3) 尽可能吸取培养基,不要损伤细胞(冰上操作);
  4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿,去掉PBS,重复洗涤1次;
  5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS,每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II;
  6) 每培养皿加入2 ml PBS,刮取细胞至锥形管;
  7) 4℃离心700rpm,时间5min以沉淀细胞,去掉上清;
  8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer;
  9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞;
  10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。
 2、超声处理裂解DNA  
  1) 管子置于碎冰上,超声处理以打碎DNA,超声发热会部分降解染色质,注意在冰上操作,普通贴壁细胞约1x 10-7个细胞/ml需要10次,每次4-5秒的超声处理;
   超声仪基本要求:50-100WW功率,1-2mm探头。
  2) 4℃离心12000rpm,时间10min,移除沉淀,留下上清。
  3) 上清转移至干净的微量离心管,每管约50-100ul;
 3、免疫共沉淀蛋白质/DNA
  准备稀释液(Dilution Buffer,,含蛋白酶抑制剂)置于冰上备用,
  按照1块胶计算(9个样本):900ul稀释液中加入4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II。
  注:IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II)和阴性对照(Normal IgG),阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致。
  略
4、蛋白/DNA-复合物洗脱 
  预先准备:将1M的NaHCO3恢复至室温,使沉淀溶解。,
  1) 准备Elution Buffer以备IP管和input对照管使用“见C(5)”,每管按照如下准备200ul elution buffer:10 ul 20% SDS,20ul 1 M NaHCO3和 170 ul sterile, distilled water。
  2) C(5)input对照管加入200 ul Elution Buffer放置于室温备用,步骤E备用;
  3) C(10)完成后,每管(IP管)加入100ul Elution Buffer,混匀于室温孵育15min;
  4) 3000rpm离心1min以沉淀Pellet agarose,收集上清至新离心管;
  5) 重复4-5步骤,最终收集上清约200ul。
5、逆转蛋白/DNA交联(留取目的DNA片段)
  略
6、目的DNA的纯化
  取出Spin Filter-Collection Tube(自旋过滤器/收集管)和单独的收集管Collection Tube备用;
  略
  弃去Spin Filter,收集管Collection Tube里面的洗出液即为纯化的DNA,可以进行下一步实验操作或冻存于-20℃.
7、 PCR of Controls
  1) 试剂:
    PCR Master Mix(2x), Jiamay Biotech
    DNA Marker DL2000, Jiamay Biotech
    0.1% DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇
    AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499
    10×DNA上样缓冲液, Jiamay Biotech
     0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备
   1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
 2) 仪器:
    (1) PCR仪,ABI9600
    (2) 电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型
    (3) 高速离心机,湘仪H1650-W
    (4) 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751)
    (5) 成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
  3)PCR(25μL体系)
    Composition    Volume(μL)
    目的DNA    1.0
    Primer sense(10μmol/L)    0.5
    Primer anti-sense(10μmol/L)    0.5
    PCR Master Mix(2x)    12.5
    PCR H2O    10.5
 
    Composition of PCR Master Mix(2x):
    0.05units/ul Taq DNA Polymerase in reaction buffer,
    4mM Mgcl2,0.4mM dNTP
  4)PCR扩增程序:
    Temperature    Time
    95℃    5min
    94℃    30s   40Cycles
    57℃    30s   40Cycles
    72℃    30s   40Cycles
    72℃    5min
    4℃    ∞
  5)产物用琼脂糖凝胶电泳检测
    扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
5、凝胶图片与平均光密度值
阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。


第一次


第二次
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