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Cas9实验案例:CRISPR/Cas9基因编辑构建细胞株

一、嘉美实验 CRISPR/Cas9 载体系统介绍
嘉美实验拥有完善的 CRISPR/Cas9 载体系统,包括单敲除,双敲除,缺口酶、慢病毒敲除载体和敲除载体库等体系。并且每一个载体系统都有不同的标签(EGFP/RFP/Puro/Neo)可供选择。同时,拥有 100 余种基因敲除的项目经验,可以快速、准确、高效的完成任何一个基因敲除的项目。

二、实验步骤
1、设计针对 Atg10基因的 gRNA并克隆到嘉美实验的 pGK1.1敲除载体中;
2、电转 pGK1.1(Atg10)载体至 K562细胞中;
3、Cruiser™酶切计算突变率(图1);
4、单克隆筛选用 Cruiser™酶切验证获得潜在阳性克隆(图2);
5、对潜在的阳性克隆进行测序验证,获得纯合子;

图1. Cruiser™酶切细胞池,计算突变率。


 

图3. 潜在阳性克隆测序比对结果
根据潜在阳性克隆单克隆测序验证结果,判断该株疑似阳性克隆的两个亲本都缺失11bp碱基,该株阳性克隆为纯合子敲除细胞株。
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