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DLBCL细胞生物学行为影响及其对BCL6表达的调控

一、嘉美实验实验内容
嘉美实验建立了DLBCL细胞的粘附评价模型:以评价ly1和HBMEC的粘附为例,实验前一天,HBMEC细胞接种至24孔板中,分别置于常氧培养箱和低氧培养箱,培养过夜,使细胞密度融合至80%以上。同时LY1细胞也分别置于常氧培养箱和低氧培养箱,培养过夜。常氧和低氧培养的LY1细胞分别接种于常氧与低氧培养的HBMEC细胞的培养孔中,5E5/孔,1500rpm,室温离心20min,再分别置于常氧与低氧培养箱中培养30min。弃培养液,用PBS清洗3次,显微镜下观察。如下图所示:
二、课题背景
1、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的成人非霍奇金恶性淋巴瘤,占西方国家成人非霍奇金恶性淋巴瘤的30~40%,在发展中国家,所占的比例更高达60%。在儿童淋巴瘤中,DLBCL所占的比例在10%以下。DLBCL发病年龄范围很广,平均发病年龄70岁,但亦可见于儿童;男性患者多于女性。DLBCL为弥漫性增生的肿瘤性大B淋巴样细胞,核的大小相当于正常吞噬细胞核或正常淋巴细胞的两倍。DLBCL在Kiel分类中属于中心母细胞、B免疫母细胞和B细胞来源的间变性大细胞淋巴瘤。在工作分类中,属于弥漫性大细胞(有裂或无裂)或免疫母细胞型,偶属于弥漫性大小混合细胞型。在REAL和WHO分类中,DLBCL包括三种病理亚型和六种变异型。DLBCL病理形态上肿瘤细胞表现为大细胞,胞核大,两倍于小淋巴细胞淋巴瘤。大部分情况下,主要的肿瘤细胞和中心母细胞(大无裂细胞)或免疫母细胞相似,最常见的表现为中心母细胞样和免疫母细胞样混合。其它细胞类型包括大裂或多叶细胞、间变性大细胞,后者和T/裸细胞来源间变性大细胞淋巴瘤相一致。某些DLBCL富有小的T细胞或组织细胞,在工作分类中属于弥漫性大小混合细胞型,它和T细胞淋巴瘤或淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤相似。如下图所示:
2、DLBCL的B细胞相关抗原CD19、CD20、CD22和CD79a阳性,SIg和CIg+/-,CD45+/-,CD5+/-,CD10+/-。30%的病人有Bcl-2基因重组。根据基因分析结果,DLBCL可分为两种或三种亚型:生发中心B 细胞型(gcb)、激活外周血B细胞样型(ABC)和第3型。生发中心B细胞型的预后明显优于后两型。应用寡核苷酸阵列分析技术分析弥漫性大B细胞淋巴瘤的基因图谱,可将DLBCL分为两个预后不同的群体:B细胞受体调节信号、重要苏氨酸/丝氨酸磷酸化途径和凋亡相关基因高表达和低表达两组,高表达组病人预后不良。Bcl-6和CD10是生长中心B 细胞的标记物,而MUM1主要表达于浆细胞和B细胞发育的晚期阶段,为非GCB的标志物。因此,应用免疫组化检测CD10、Bcl-6和MUM1表达,以诊断DLBCL的病理亚型:生长中心B细胞型和非生发中心型。GCB诊断标准为CD10阳性(CD10或 MUM±)或CD10和Bcl-6共同阳性;如果CD10和Bcl-6均阴性,诊断为非GCB型。如果Bcl-6阳性而CD10阴性,根据MUM1表达决定亚型:MUM1阳性为非GCB,阴性为GCB。应用免疫组化标准可以较准确地预测病人的预后。P53突变在DLBCL占 6%~33%,P53蛋白表达占13%~70%。

3、与预后相关的因索包括CD5、CD30、Bcl-6、MUM-1、EBER、GCET-1、FOXP-1、LMO2、Ki-67、c-MYC及免疫分型、临床指标等。1)CD5:CD5阳性率约10%,形态学上大多为中心母细胞型,且bcl-6(+)CD10(-)。2)CD30:研究表明,提示CD30表达和EBV感染可能协同促进DLBCL不利因素的作用。3)Bcl-6:Bcl-6蛋白表达阳性者预后较阴性者好。4)MUM-1:MUM-1阳性表达率为70%左右,多表达与免疫母细胞形态的DLBCL中。5)EBER:EBV阳性的DLBCL临床预后比阴性的要差。6)GCET-1、FOXP-1:有文献报道,GCET-1阳性表达与预后呈正相关,而FOXP-1阳性表达与预后呈负相关。7)LMO2:可作为预测DLBCL预后良好的独立指标。8)Ki-67:有研究显示,Ki-67高表达患者接受化疗总体有效率与Ki-67低表达患者无明显差异,但高表达患者无进展生存时间显著低于低表达患者,且Ki-67高表达者接受R-CHOP方案长期疗效明显优于CHOP方案,但低表达者两种化疗方案上未查见明显差异。

4、DLBCL是最常见的一种淋巴瘤,由于存在异质性,目前的研究均较局限。近来的研究发现了很多判断DLBCL预后的免疫组织化学标记物及临床指标,增加了对DLBCL分子水平的认识,对疾病发生发展的深入研究更具前瞻性的意义。随着对肿瘤生物学特点不断深人的认识,对治疗效果的评估更成为日后关注的热点,所以有待更多的研究进一步认识DLBCL疾病的本质,以利于更有效的针对性治疗和提高患者生存率。
 
 
三、课题目的:PI3K/Akt/mTOR信号传导通路对DLBCL细胞生物学行为影响及其对BCL6表达的调控

四、实验路线
1、LY294002、Rapamycin和胰岛素能有效地调控PI3K/Akt/mTOR信号传导通路
2、Akt活化在DLBCL的发生中可能起重要作用,它与细胞周期和细胞增殖密切相关,与细胞凋亡无显著相关;
3、Akt主要通过p27和cyclinD1控制细胞周期的分布
4、PI3K抑制剂LY294002对doxo诱导DLBCL细胞凋亡的促进作用,提示其可能是DLBCL治疗中一潜在具有较好的化疗增敏作用的分子靶向药物
5、Akt/mTOR信号通路可能通过调节翻译起始因子eIF4E和eIF4G的磷酸化水平调控BCL6翻译表达

五、课题结论:
1、发现三株DLBCL细胞ly1、ly8和ly10中均存在不同程度的Akt组成性活化。
2、PI3K/Akt/mTOR信号通路对DLBCL细胞株细胞生物学行为的调控可能通过Akt直接调节细胞周期相关蛋白的表达而并非进一步通过mTOR信号通路调控细胞生物学行为。
 
六、成果文献
1、DLBCL transformation in NLPHL. Blood. 2016 Apr 21;127(16):2043.
2、JMJD3 promotes survival of diffuse large B-cell lymphoma subtypes via distinct mechanisms. Oncotarget. 2016 Apr 19;8836.
3、Disruption of KMT2D perturbs germinal center B cell development and promotes lymphomagenesis. Nat Med. 2015 Sep 14;nm.3940.
4、Targeting B cell receptor signaling with ibrutinib in diffuse large B cell lymphoma. Nat Med. 2015 Aug;21(8):922-6.
5、Mutations in the Gα13 Pathway Promote GCB-DLBCL Progression. Cancer Discov. 2014 Dec;4(12):OF13. 2159-8290.
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