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整体实验:逆转心肌纤维化的分子生物学机制

一、课题模型
1、嘉美实验已经掌握了成年大鼠心脏成纤维细胞的离体培养模型:以组织块消化法分离细胞,以差数贴壁法去除其他细胞;刚消化分离下来的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个或聚集成细胞团。接种30分钟后即有大量细胞贴壁,1-2小时后大多数贴壁细胞已伸展呈梭形;1-2天后细胞散在生长,呈细长梭形或多角形,胞核清晰。4-5天后可生长成细胞单层,漩涡状排列或纵横交错,如下图所示:
2、嘉美实验建立了血管紧张素II对心脏成纤维细胞的作用评价模型:使用血管紧张素II刺激后,心脏成纤维细胞数目显著增多,可引起成纤维细胞的分化(表现为alpha-SMA表达增加);另外可以刺激细胞内ROS的增加,如下图所示:
二、课题背景
1、心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。该病理变化是临床多种心血管疾病发展到终末阶段的必然过程,是心脏结构重构的主要表现。目前认为其与心律失常、心功能障碍甚至心原性猝死密切相关。研究已证实心肌纤维化与心房颤动、室性心动过速、心室颤动的发生密切相关。心肌纤维化导致心肌细胞之间正常结构被增多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原打乱,缝隙连接蛋白由正常的端–端连接变为侧–侧连接,分布紊乱,进而引起心脏电传导功能障碍。另外,间质胶原的聚集和肌成纤维细胞增殖又促进提高自律性和早期后除极(EAD)引起的触发活动。抗纤维化治疗有望成为治疗心律失常的新型手段。

2、心肌纤维化以成纤维细胞的增殖和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积为主要特征,如下图所示。ECM的沉积引起心脏硬度增加,顺应性降低,影响心脏的正常舒张和收缩功能。心肌纤维化是决定心血管疾病预后的关键性因素。纤维化心脏中的成纤维细胞是一种高度异质性的细胞群体,这种异质性是其来源不同引起的。目前认为纤维化心脏中成纤维细胞主要有3个来源,即心脏本身的成纤维细胞,通过内皮间质转化(endothelial–mesenchymal transition,EndMT)为成纤维细胞,以及循环中的骨髓祖细胞、单核细胞和纤维细胞。健康心脏中,成纤维细胞对维持心脏的正常结构、电传导、机械收缩和舒张功能均起到重要作用。病理状态下,成纤维细胞作为主要作用细胞,通过多种来源、多种途径聚集在心脏,通过多种机制转化为肌成纤维细胞并通过分泌胶原蛋白和生物活性因子2种功能引起心肌纤维化,为疾病的发生、发展提供了病理基础。因此,在改善相关疾病预后、抑制心脏结构重构的细胞层面上,成纤维细胞已经成为控制纤维化进展的重要靶细胞。
3、成纤维细胞可以合成并分泌多种的生物活性分子,如细胞因子、生长因子和活性肽,包括TGF–β、IL–6、肿瘤坏死因子(TNF–α)、AngⅡ、ET–1和B型利钠肽。已经证实,其中TGF–β、TNF–α、IL–6等因子参与了心肌纤维化的过程。TGF–β是心肌纤维化过程中处于核心位置,单纯过表达的TGF–β转基因小鼠本身存在纤维化。TNF–α通过TGF–β调节ECM的表达。IL–6通过TGF–β/Smad3导致肌成纤维细胞和Ⅰ型胶原蛋白的增多。另外,成纤维细胞还产生ECM的主要调控蛋白—具有降解ECM蛋白作用的基质金属蛋白酶(MMP)和其抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)。MMP和TIMP之间的平衡是维持ECM动态平衡的重要因素。MMP是降解ECM蛋白的主要蛋白酶。已发现MMP有26个亚型,其中下列亚型参与了心肌纤维化,即MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP2、MMP9、MMP12、MMP28和膜型基质金属蛋白酶(MT1–MMP/MMP14)。MMP1降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白和基底膜蛋白,MMP2和MMP9降解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白。TIMP是抑制MMP作用,抑制ECM降解的酶类。TIMP有4种亚型,健康心脏中含有TIMP2、TIMP3和TIMP4,而TIMP1在健康心脏中表达量很低,在疾病心脏中表达量较高。MMP不仅在基质降解中发挥作用,而且也调节胶原蛋白的合成。正常的胶原蛋白被升高的MMP降解并被缺乏连接结构的纤维状间质取代,导致纤维化增加。不同的刺激物,包括氧自由基,都能激活MMP从而增加纤维化的发生。同样,下调TIMP也会导致纤维化增强。研究发现慢性心力衰竭而无心房颤动的患者心脏房室的胶原成分、MMP和TIMP有明显的改变。研究证实TIMP可抑制慢性心力衰竭小鼠模型中心房纤维化。这些研究提示MMP和TIMP成为心房纤维化潜在的治疗靶位点。成纤维细胞生成的生物活性分子也可以影响MMP和TIMP。TNFα和IL–1β诱导转录的MMP、TIMP1及TIMP2。B型利钠肽诱导成纤维细胞表达MMP1、MMP2、MMP3、MMP14和TIMP2。
 
三、课题目的:阐明阿伐他丁对SHR(自发性高血压大鼠)的心肌纤维细胞胶原降解和逆转心肌纤维化的分子生物学机制
 
四、实验路线
1、阿伐他丁可显著抑制SHR大鼠心肌纤维细胞增殖与胶原合成,呈浓度和时间依赖性
2、SHR大鼠心肌纤维细胞的NOS-NO系统功能异常,表现为NOS活性降低,NO含量减少。阿伐他丁使SHR心肌纤维细胞内NOS-NO系统活性显著增高。
3、阿伐他丁可显著升高SHR心肌纤维细胞的PTEN蛋白水平,促进其凋亡
4、阿伐他丁作用下,SHR心肌纤维细胞的NF-kB表达减弱,NF-kB表达量降低
5、阿伐他丁以浓度依赖方式诱导SHR心肌纤维细胞的明胶酶活性增强,可显著升高MMP-1蛋白水平,抑制TIMP-1蛋白水平

五、实验结论:阿伐他丁参与了心脏间质降解的调节,防止原发性高血压心肌纤维化和逆转左室肥厚的发生和发展

六、成果文献
1、Endothelial­to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis[J]. Nat Med, 2007, 13:952-961. http://dx.doi.org/10.1038/nm1613
2、Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 2009 Dec 4;105(12):1164-76. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmid/19959782/
3、Endothelial cell­derived endothelin­1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial­to­mesenchymal transition[J]. Circulation, 2010, 121:2407-2418. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20497976
4、Heart­infiltrating prominin­1+/CD133+ progenitor cells represent the cellular source of transforming growth factor beta­mediated cardiac fibrosis in experimental autoimmune myocarditis[J]. Circ Res, 2009, 105:462-470. http://circres.ahajournals.org/content/105/5/462.full
5、Cardiac Fibrosis. The Fibroblast Awakens. Circulation Research. 2016; 118: 1021-1040. http://circres.ahajournals.org/content/118/6/1021.abstract
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