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CRISPR/Cas9整体实验服务


1、提供项目CRISPR/Cas9整体实验方案:客户根据课题标书及需做实验的主体内容,拟定并提供初步的项目方案,含课题申请书,实验方案,实验设计,实验思路,实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成CRISPR/Cas9整体实验方案的设计。
2、项目评估报价:公司技术团队根据客户提供的相关资料,综合评估项目可行性,与客户共同确定准确的实验项目执行方案,给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。
3、签订服务协议:签署服务协议并预付部分费用,做好实验初步准备及项目预安排。
4、执行服务项目:正式启动实验进程,全面展开实验,确保项目有效执行。
5、沟通项目进展:及时沟通反馈实验的最新进展,随时了解掌控实验的最新动态。
6、完成项目交付:支付剩余尾款,交付实验结果,正确应用实验结果,提供售后服务。


一、嘉美实验构建的CRISPR/Cas9 基因编辑稳定细胞株案例的实验步骤
 

 
嘉美实验拥有完善的 CRISPR/Cas9 载体系统,包括单敲除,双敲除,缺口酶、慢病毒敲除载体和敲除载体库等体系。并且每一个载体系统都有不同的标签(EGFP/RFP/Puro/Neo)可供选择。同时,拥有 100 余种基因敲除的项目经验,可以快速、准确、高效的完成任何一个基因敲除的项目。
1、设计针对 Atg10基因的 gRNA并克隆到嘉美实验的 pGK1.1敲除载体中;
2、电转 pGK1.1(Atg10)载体至 K562细胞中;
3、Cruiser™酶切计算突变率(图1);
4、单克隆筛选用 Cruiser™酶切验证获得潜在阳性克隆(图2);
5、对潜在的阳性克隆进行测序验证,获得纯合子;

图1. Cruiser™酶切细胞池,计算突变率。


 


图3. 潜在阳性克隆测序比对结果
根据潜在阳性克隆单克隆测序验证结果,判断该株疑似阳性克隆的两个亲本都缺失11bp碱基,该株阳性克隆为纯合子敲除细胞株。

 

、CRISPR-Cas系统介绍

CRISPR-Cas系统 The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems)是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物,包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示,与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)相比较,CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。
 

在 II型CRISPR系统 中,CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)退火形成的复合物能特异识别基因组序列,引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对;靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。

CRISPR-Cas9体系 的RNA-DNA识别机制为基因 组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图
 

 

优势  
  RNA导向的基因组DNA识别,无需考虑DNA甲基化
  较ZFN和TALEN,有相同或更高的基因编辑效率
  可同时编辑多个基因(多重靶向编辑)
  设计简单快速,无需重复构建核酸内切酶

 

 



图2. CRISPR-Cas9介导的基因编辑。
(左):sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组,形成的DSBs被非同源末端连接(NHEJ)机制修复;
(右):sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组,形成DSBs,同源重组(HR)作用下,供体质粒上的目标基因及筛选标记(或其他遗传元件)在断裂处被整合进基因组。

 

 

 

 

图3: 切口酶在结合链生产单链切口的原理图
 

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TALEN与CRISPR-Cas9体系对比
     
特性 TALEN CRISPR-Cas9
识别方式 蛋白质–DNA RNA-DNA
甲基化敏感性 敏感 不敏感
染色质结构敏感性 敏感 敏感
脱靶效应 较少观察到脱靶效应 潜在脱靶效应高于 TALEN 及ZFN
多靶点操作 极少用 可用

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