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长链非编码RNA整体实验


1、提供长链非编码RNA(LncRNA)整体实验方案:客户根据课题标书及需做实验的主体内容,拟定并提供初步的项目方案,含课题申请书,实验方案,实验设计,实验思路,实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成长链非编码RNA(LncRNA)整体实验方案的设计。
2、项目评估报价:公司技术团队根据客户提供的相关资料,综合评估项目可行性,与客户共同确定准确的实验项目执行方案,给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。
3、签订服务协议:签署服务协议并预付部分费用,做好实验初步准备及项目预安排。
4、执行服务项目:正式启动实验进程,全面展开实验,确保项目有效执行。
5、沟通项目进展:及时沟通反馈实验的最新进展,随时了解掌控实验的最新动态。
6、完成项目交付:支付剩余尾款,交付实验结果,正确应用实验结果,提供售后服务。

 

 
一、非编码RNA(Non-coding RNA)介绍
1、非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多种已知功能的 RNA,还包括未知功能的RNA。目前主要研究方向集中在非编码RNA 及其相互结合的DNA、RNA、蛋白质等科学问题,而科学问题的解答依赖于实验技术的创新使用和革命。
2、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)
是一类长度>200bp的RNA,由RNA聚合酶Ⅱ转录,lncRNA具有保守的二级结构,大部分不编码蛋白质。LncRNA发挥功能的方式很广,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等,从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。
 

 
3、LncRNA火热的十年。近年来,LncRNA相关研究在国内外的热度居高不下,早在1991年,Xist 调控X染色体的失活就登上Nature,但当时认为这只是一种特殊情况。2007年Howard Chang在Cell上发表题为“Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs”的论文,正式开启了LncRNA火热的十年。
 



谷歌学术显示该文章引用量高达2854次
 
二、LncRNA详解
下面从以下5个方面来介绍LncRNA:LncRNA的定义、LncRNA的发现、LncRNA的分类、LncRNA的功能
以及LncRNA的作用模式
1、LncRNA的定义

LncRNA(Long non-coding RNA),是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,一些LncRNAs,长度超过90kb,也被称为macroRNA,如 Airn 和 KCNQ1OT1。标准“非编码”是指在转录本中缺少开放阅读框 和/或 保守密码子,2011年 Cell发表论文表明LncRNA可以被核糖体吸引,其中一些能翻译产生小肽。 编码肽的能力与转录产物充当功能性RNA的能力并不一定冲突, 事实上,越来越多的证据表明双功能转录产物既可以作为蛋白质模板,也可以作为LncRNAs。
 
Cell论文证实LncRNA能翻译产生小肽
 
2、LncRNA的发现
LncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”,是RNA聚合酶II转录的副产物,不具有生物学功能 。然而,1991年,Nature等杂志刊文证实 Xist参与X染色体失活的调控(图4)。此后越来越多的研究表明,LncRNA在众多生命活动过程中发挥重要作用,LncRNA开始引起人们广泛的关注。再加上二代测序技术的发展,大量 LncRNA 被发现。
 
发现Xist参与X染色体失活
 
3、LncRNA的分类
  1)正义LncRNA,与编码基因的一个或多个外显子重叠;
  2)反义转录产物,与相反链上的转录产物部分或完全互补;
  3)内含子LncRNA,由基因的内含子产生;
  4)双向转录产物,与蛋白质编码基因共享相同的启动子,但转录方向相反;
  5)基因间LncRNAs(LincRNA),由位于蛋白质编码基因之间的序列独立转录;
  6)增强子RNA(eRNA),由蛋白质编码基因的增强子区域产生;
  7)circRNA,由转录产物剪接并形成共价闭合的环状RNA。
注:该处将circRNA归类于LncRNA


4、LncRNA的功能
LncRNA 在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,也与包括癌症在内的多种疾病息息相关,也正因此成为生命科学领域的研究热点。
RNA不仅仅是承担遗传信息中间载体的辅助性角色,而是更多地承担了各种调控功能。LncRNA发挥功能主要依靠其二级结构,与蛋白质结合,可引起染色质重构、影响转录因子功能等。另外,还可以在其线性水平与miRNA结合,间接影响mRNA表达,也可以直接与mRNA结合,影响mRNA翻译、剪切、降解过程。LncRNA在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极大地解释了基因组复杂性之难题,同时也为人们从基因表达调控网络的维度来认识生命体的复杂性开启新的天地。但是目前对LncRNA的认知可以说还处在初级阶段,前路漫漫,还有许多需要探索。

5、LncRNA的作用模式
LncRNA 的作用模式主要分为四大类: signal、decoy、guide、scaffold。

  1)signal-信号
  LncRNA的第一种作用是调控下游基因转录。已有的研究发现,不同的刺激条件和信号通路下,LncRNA将会被特异性地转录,并作为信号传导分子参与特殊信号通路的传导。一些LncRNA分子被转录后,拥有调控下游基因转录的作用。从生物体的角度而言,利用RNA进行转录调控是具有明显优势的,因为利用RNA进行调控,由于不涉及蛋白质的翻译,因此具有更好的反应速度,对于机体的某些急性反应可以做出更好更迅速的相应。
  2)decoy-诱饵
  LncRNA的第二种作用是分子阻断剂。这一类LncRNA被转录后,它会直接和蛋白(与这类LncRNA相互作用的蛋白都是转移因子/转录调节子)结合,从而阻断了该分子的作用和信号通路。由于LncRNA的结合,这类转录因子的功能被阻断,从而调控下游的基因转录。
  3)guide-引导
  第三种作用模式是LncRNA与蛋白结合(通常是转录因子),然后将蛋白复合物定位到特定的DNA序列上。研究发现LncRNA介导的这种转录调控作用可以是顺式作用模式,也可以是反式作用机制,因此仅仅从LncRNA的序列上是无法获得信息的。
  4)scaffold-支架
  LncRNA 还可以起到一个“中心平台”的作用,即多个相关的转录因子都可以结合在这个LncRNA分子上。在细胞机体中,当多条信号通路同时被激活,这些下游的效应分子可以结合到同一条LncRNA分子上,实现不同信号通路之间的信息交汇和整合,有利于机体/细胞迅速地对外界信号和刺激产生反馈和调节。


三、LncRNA的研究思路
LncRNA的相关研究逐渐成为了当今生物医学最热门的研究领域之一。近几年有关LncRNA研究的国自然立项数连年增长,2016年261项,2017年更是达到了345项,在这里讲一下LncRNA研究中经典的ABCD模式——A基因通过B基因/信号通路在C疾病中发挥D功能。
先看一下以下这四篇影响因子5分左右的LncRNA研究的文章的题目。

 
以上4篇5分左右的LncRNA研究文章,从题目来看,都符合A基因通过B基因/信号通路在C疾病中发挥D功能的模式。
 
【嘉美实验课题实验分析】以长征医院李兵教授和陈万生教授作为通讯作者发表在《Cancer Letter》的 LncRNA-UCA1 exerts oncogenic functions in non-small cell lung cancer by targeting miR-193a-3p为例,来讲一下LncRNA研究中典型的ABCD模式。首先我们看一下该文章的题目:LncRNA-UCA1(A基因)通过靶向miR-193a-3p(B基因)在非小细胞肺癌(C疾病)中发挥致癌作用(D功能)。可以说是完美符合ABCD模式

  1)确定研究对象C疾病——非小细胞肺癌
  本文的研究对象是肺癌,肺癌是最常见的癌症之一,并且是全世界癌症相关死亡率的主要原因。非小细胞肺癌在诊断的肺癌病例中占大多数。

  2)确定研究A基因——LncRNA-UCA1
  LncRNA-UCA1是人类尿路上皮癌相关的LncRNA, 最初在人类膀胱癌中被鉴定,调节和发挥致癌功能。2014年,Li.等人报道UCA1通过mTOR-STAT3/microRNA143通路促进糖酵解,引发UCA1可能作为竞争性内源RNA(ceRNA),介导与靶标miRNA结合来发挥致癌作用的猜想,这一猜想随后在肝癌中被证实。
   (1)本文作者首先在112对非小细胞肺癌组织和5种人类非小细胞肺癌细胞系中发现UCA1的表达增高,并且UCA1的高表达与预后不良有关,如下图:

 
 
  2)随后进行体外实验验证,做了最常用的过表达和干扰的实验,在A549 和 H1299非小细胞肺癌细胞系中过表达和敲低UCA1,发现UCA1促进细胞增殖和克隆形成(如下图)。说明异常表达的UCA1与非小细胞肺癌的恶性程度的确有关,但是UCA1通过什么机制来发挥其致癌活性仍是未知
 
   3)LncRNA-UCA1的分子机制——通过B基因发挥D功能
   (1)最近有报道称UCA1参与肿瘤的发展是通过作为特定miRNA的ceRNA来实现的。因此作者猜测UCA1在非小细胞肺癌中也是通过类似机制发挥致癌活性。作者首先通过在线microRNA-target程序(http://www.microRNA.org,http://www.mircode.org) 预测了miRNA的靶定位点,找出了10个常见的UCA1相关结合位点的miRNAs。通过qRT-PCR检测发现过表达UCA1后,miR-135a, miR-18a, miR-143, 和miR-193a-3p的表达水平显著降低。通过免疫共沉淀实验(CHIP)发现,在RNA诱导沉默复合体(RISC)核心元件Ago2中检测到了miR-135a, miR-18a, miR-143, miR-193a-3p 以及 UCA1,但是miR-193a-3p被富集的最多。为了进一步确认,作者构建了UCA1-wt或者UCA1-Mut(突变掉miR-193a-3p结合位点)的报告基因载体,发现UCA1-Mut不再抑制miR-193a-3p,再次证明了miR-193a-3p是一个UCA1-targeting的miRNA。随后作者在相同的112对非小细胞肺癌组织中随机挑取32对检测了miR-193a-3p的表达,发现miR-193a-3p表达水平明显较低,并与UCA1的表达水平呈负相关(如下图)。
(2)紧接着作者发现在A549 和H1299细胞中过表达miR-193a-3p减弱了UCA1对细胞增殖的促进作用(如下图),说明UCA1促进肿瘤细胞的生长某种程度上依赖于竞争性地结合miR-193a-3p。
(3)已知在非小细胞肺癌中,miR-193a-3p通过下调ERBB4发挥肿瘤抑制的作用。作者发现,过表达UCA1-wt显著增加了ERBB4的蛋白水平,过表达UCA1-Mut对ERBB4的蛋白水平无影响,然而敲低UCA1显著降低了ERBB4的蛋白水平,并均不影响ERBB4的mRNA水平(如下图)。
 
 UCA1通过竞争性海绵作用结合miR-193a-3p,解除了miR-193a-3p对ERBB4的抑制,进而发挥了其致癌的功能。到这里,A基因通过B基因/信号通路在C疾病中发挥D功能的模式就讲完了。

参考文献:
1、Rinn John L,et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.[J] .Cell, 2007, 129(7): 1311-23.
2、Ingolia Nicholas T,et al.Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.[J] .Cell, 2011, 147(4): 789-802.
3、Beermann Julia,et al. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.[J] .Physiol. Rev., 2016, 96(4): 1297-325.
4、Borsani G, et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome[J]. Nature, 1991, 351(6324):325.

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