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氧化应激/衰老整体实验

 
1、提供氧化应激与衰老整体实验方案:客户根据课题标书及需做实验的主体内容,拟定并提供初步的项目方案,含课题申请书,实验方案,实验设计,实验思路,实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成各氧化应激与衰老整体实验方案的设计。
2、项目评估报价:公司技术团队根据客户提供的相关资料,综合评估项目可行性,与客户共同确定准确的实验项目执行方案,给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。
3、签订服务协议:签署服务协议并预付部分费用,做好实验初步准备及项目预安排。
4、执行服务项目:正式启动实验进程,全面展开实验,确保项目有效执行。
5、沟通项目进展:及时沟通反馈实验的最新进展,随时了解掌控实验的最新动态。
6、完成项目交付:支付剩余尾款,交付实验结果,正确应用实验结果,提供售后服务。

 
 
一、氧化应激与衰老介绍

 
 1、衰老是机体代谢过程中一个进行性的必然阶段,是机体健康水平和维持自身内稳态能力的退行性改变,表现为机体对环境的适应能力减弱以致丧失。衰老始于机体发育成熟并获得繁殖能力之后,伴随着机体老化,组织器官功能逐渐衰退,死亡的概率增加。一般认为人的最高寿限大约为120岁。

2、衰老是一个多环节的生物学过程,是多因素共同作用的结果,其机制颇为复杂,涉及到机体各个系统结构与功能的改变。这些改变可以增加生物死亡的概率,同时也往往伴随疾病的发生。目前还没有一种理论能解释所有的衰老现象。有关衰老的理论颇多,如遗传控制理论、体细胞突变理论、神经内分泌理论、免疫理论、生活速率理论、生殖与老化理论以及氧化应激理论等。尽管关于衰老有许多假说不断被提出,但导致生物体增龄性功能改变和寿命改变的机制仍不明确,其中大多理论都是建立在生物体内在衰老重要作用的基础之上,而环境因素对衰老的发生发展同样不容忽视。环境因素既包括生物体外部环境也包括生物体内部环境。氧化应激理论的提出即是考虑了环境因素对衰老的影响。

3、衰老的自由基理论同时涵盖了损伤积累衰老理论和基因程序衰老理论。核心观点包括以下几点:①细胞代谢过程中不断产生的自由基造成的细胞损伤是引起机体衰老的根本原因之一。②造成细胞损伤的自由基主要是氧自由基,而大部分的活性氧基团(ROS)主要由线粒体产生,线粒体作为细胞呼吸和氧化的中心与衰老密切相关。③在体内维持适当的抗氧化剂和自由基清除剂可以延长寿命和延缓衰老。

4、机体在遭受有害刺激时,体内活性氧(ROS)产生过多,超出了机体的清除速度,氧化系统和抗氧化系统失衡,过剩的ROS参与细胞内反应,引起氧化应激。氧化应激通过损伤DNA使维持细胞基本生理功能的基因失去表达活性,进而导致细胞衰老,从而导致组织损伤。在生物体的衰老过程中,机体组织细胞不断产生的自由基逐渐累积,由于自由基反应能力较强,可氧化细胞中的多种物质,损伤生物膜,造成蛋白质、核酸等大分子交联,因而影响其正常功能。此后自由基学说被HelmutSies等发展为“氧化应激假说”,该学说认为衰老过程中机体抗氧化成分的减少导致清除自由基的能力减弱,进而导致生物大分子结构损伤的增龄性累积。人体可以被理解成一个氧化与抗氧化的系统,随着年龄增加,自由基不断累积,机体平衡被打破,倾向氧化,进而导致了疾病与衰老。尽管以上学说存在争议,但近年来越来越多的研究证实生物大分子的氧化与癌症、心脑血管疾病、肾病、糖尿病、帕金森病、阿尔兹海默病等衰老相关疾病以及衰老本身密切相关,氧化应激即便不是诸多疾病的病因,也是一个重要的危险因素。

5、衰老的氧化应激理论认为,活性氧造成的DNA损伤是衰老的诱发事件。在衰老过程中一方面自由基的生成速率可能增加,另一方面机体氧化与抗氧化水平失衡。氧化应激对DNA的氧化损伤在正常代谢状况下以很高的频率发生,氧化应激导致DNA损伤最易发生的部位是碱基中的胸腺嘧啶和鸟嘌呤。
6、近来一种新的渐进性的ROS衰老理论被提出:衰老早期阶段,衰老相关的DNA损伤产生低剂量ROS,由于体内的抗氧化体系这些ROS并不会引起机体损伤,反而会触发机体保护性的压力应激反应,延缓衰老。当年龄增加,衰老相关的DNA损伤在体内持续聚集,ROS大量产生,超过了机体的清除能力,这些蓄积的ROS进一步造成DNA损伤,加剧衰老相关性DNA损伤,加速细胞的衰老,造成恶性循环。
 
 
 
二、氧化应激与自由基的联系
 1、氧化应激是指机体在内外环境有害刺激的条件下,体内产生活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)等等;RNS有一氧化氮(NO)、二氧化碳(CO2)和过氧亚硝酸盐(ONOO-)等等。

2、自由基的危害与作用
  1)危害:它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质,可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化,被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病(老年痴呆)、糖尿病------最主要的危险因子,是人类健康的大敌!
  2)作用:生物氧化,氧化还原反应是人体最基本的生化反应,氧化应激亦是人体一种最基本的保护机制。在我们体内,每一个细胞一天要产生2.5X1011个分子的ROS,人体内每天可产生4X1021个分子的自由基。它们不仅为我们提供和传递为维持生命活动的能量,帮助我们消灭细菌和病原体,清除体内的毒素和“垃圾”。所以氧化应激和自由基亦是我们的朋友我们人体不能没有,也不能“消灭”它!
  3)简述抗氧化系统中一些简单的自由基清除剂及产物
   (1)超氧化歧化酶(SOD),SOD它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,复原因为自由基造成的对细胞伤害。


 
   (2)过氧化氢酶(CAT),CAT它可促使H2O2分解为分子氧和水,清除体内的过氧化氢,从而使细胞免于遭受H2O2的毒害,因为H2O2会与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH。
   (3)谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px),GSH-Px它为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶以保护细胞膜结构和功能完整性的作用
   (4)丙二醛(MDA),MDA是自由基发生反应的产物,促进机体衰老。生物体内,自由基作用于脂质发生过氧化反应,氧化终产物为丙二醛,这回会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有细胞毒性 。


三、氧化应激的相关检测方法
1、抗氧化酶类的检测
  1)超氧化物歧化酶(SOD)的检测
  SOD活力的高低与自由基、低密度脂蛋白的氧化损伤有着密切的联系,测定SOD的活力可间接反应组织细胞抗氧化损伤、机体清除自由基的能力。SOD体外活性测定方法有直接法和间接法,包括电泳法、免疫法、ESR法、化学发光法、脉冲辐解法、紫外分光光度计法等。
  2)谷胱甘肽过氧化物酶的测定 
  谷胱甘肽过氧化物酶催化GSH氧化生成GSSG,用掉一个过氧化氢。在氧化应激条件下,细胞中过氧化氢浓度明显减少,因此测定GSH过氧化物酶的活力可以作为衡量细胞抗氧化水平的一项生化指标。可采用紫外分光光度计法、分光光度法或者酶联免疫吸附法等进行测定。
  3)过氧化氢酶的测定
  过氧化氢酶作用于过氧化氢的机制实质上是过氧化氢的歧化,必须有两个过氢化氢先后与过氧化氢酶相遇且碰撞在活性中心上,才能发生反应。过氧化氢浓度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法对其进行检测。

2、脂质过氧化损伤的测定
ROS攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化,如醛基丙二醛、酮基、羟基氢过氧基以及新的氧自由基等。丙二醛会引起细胞损伤,因而测定丙二醛的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度。常用硫代巴比妥酸法来测定丙二醛含量,此法是应用最多也是最古老的方法。

3、蛋白质氧化损伤的检测
蛋白质的氧化损伤不仅包括对酶、受体和载体蛋白的损伤,而且还包括一些二次损伤,如DNA修复酶的损伤。目前,蛋白质氧化使用最广的生物标志物是蛋白质羰基含量,其传统的检测技术是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶免疫吸附法测定2, 4-二硝基苯肼与蛋白质羰基反应生成的腙,来衡量蛋白质的损伤情况。一般采用Western blotting或者RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)来分析蛋白质含量以及蛋白表达情况。

4、氧化损伤致细胞凋亡相关基因的检测

  1)Bcl-2基因的检测 
  Bcl-2蛋白的上调表达可以对抗细胞的凋亡,在ROS诱导细胞凋亡的调节中,Bcl-2发挥了重要作用,Bcl-2可以减少氧自由基的产生。Bcl-2的过度表达能阻抑多种凋亡相关基因的表达。测定方法主要有印迹杂交和实时荧光定量法对它进行检测。随着近年来荧光定量聚合酶链反应术的发展,用定量聚合酶链反应技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。
  2)p53基因的检测
  p53基因属抑癌基因,是细胞生长周期中负调节因子,与细胞周期的调控、DNA的修复、细胞分化、细胞凋亡等功能相关。氧化应激导致细胞DNA损伤的过程必须有p53参与。常采用免疫组织化学、原位杂交等方法来检测。


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