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分子机制的研究

 
1、提供各种分子机制整体实验方案:客户根据课题标书及需做实验的主体内容,拟定并提供初步的项目方案,含课题申请书,实验方案,实验设计,实验思路,实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成各种分子机制整体实验方案的设计。
2、项目评估报价:公司技术团队根据客户提供的相关资料,综合评估项目可行性,与客户共同确定准确的实验项目执行方案,给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。
3、签订服务协议:签署服务协议并预付部分费用,做好实验初步准备及项目预安排。
4、执行服务项目:正式启动实验进程,全面展开实验,确保项目有效执行。
5、沟通项目进展:及时沟通反馈实验的最新进展,随时了解掌控实验的最新动态。
6、完成项目交付:支付剩余尾款,交付实验结果,正确应用实验结果,提供售后服务。  

一、分子机制研究介绍
1、分子机制研究概述
分子机制是指生物机体结构组成部分的相互关系,以及其间发生的各种变化过程的物理、化学性质和相互关系。现代分子医学的目的,就是从分子机制的角度解释疾病发生、发展等过程,并从中发展出相关的疾病风险预测、预防、诊断和治疗技术。通过分子医学实验室研究,可利用分子、细胞生物学等研究手段阐明疾病发生发展的分子机制,筛选疾病诊断的生物标志物,确定疾病治疗/干预的靶点,从而实现药物的创制。在临床上,医生可基于分子医学的临床决策,通过基因组医学实现风险预测,通过生物标志物实现疾病诊断,通过个体化医疗实现疾病治疗。

2、分子医学重点研究领域
  
1)疾病发生、发展的分子机制
  2)基因、遗传与疾病的关系
  3)个体化治疗的分子基础
  4)治疗有效性判断的分子基础


3、分子医学发展方向:
1)从机理发现向医学应用的转化
 2)新的细胞信号转导途径
 

二、嘉美实验分子机制研究的五个经验
五个经验分别为:信号通路; 明星分子; 中心法则; 工具分子; 具体位点;
1、信号通路
信号通路非常多,找到一条是关键,通路关系太复杂,讲不清楚影响这个实验设计。确定信号通路的方法有很多,特别是当我们已经把一个基因的细胞和动物功能阐述清楚后:
  1)通过文献报道或者已知经验,比如分子A的功能是影响细胞自噬,那么像PI3K-Akt-mTOR通路等就是我们可以直接通过阅读综述获取的;
  2)通过RNA-seq或者芯片或者其它组学手段,筛选差异基因并对差异基因进行pathway或者GSEA富集分析,从而找到可能被基因A调控的信号通路;
  3)通过数据库预测,比如基于与基因A存在共表达关系来分析周围基因所参与的通路,从而得到A可能参与的通路,我们可以通过cbioportal/GEPIA对TCGA收录肿瘤中的信息进行分析,也可以分析GEO等非肿瘤的共表达结果,甚至有一些网站直接收录了这种共表达关系。

2、明星分子
明星分子选得好,文章分数才能高,中游节点最常选,上下连接左右逢源。明星分子的概念大而且含糊,尽管通路是一个大的网络,但是总体上上下游关系还是存在的,如果简单来划分可以分为上游,中游和下游三段,三者之间没有严格的界限,一般的通路常常出现分子类型有:配体与受体,激酶/磷酸酶(去/泛素化酶)与底物,转录因子和靶基因等,以TGFβ-Smad通路为例,如果把细胞膜和核膜作为上中下分类的区分点,可以粗略的这么划分和标注:

那么在这个通路里面什么分子是明星分子呢?一般来说,大家选的重点集中在中游这个范围内,下游的分子(比如图中的p15)一般用来作为细胞表型(细胞周期)的证据,可能考虑到膜蛋白研究的复杂和困难性,大家也很少选择上游的分子,所以中游的分子就成了明星分子选择的重点了,特别是通路的名字叫做TGFβ-Smad,所以很多研究就是围绕Smad这个蛋白展开,比如Smad这个家族的蛋白即是转录因子,可以通过结合靶基因的DNA调控分子表达,其本身又可以被磷酸化发挥功能,所以又是激酶-底物这一关系中的底物这一角色,因此激酶-Smad-磷酸化的Smad(转录因子)-靶基因就成了一个信号轴。


  3、中心法则
中心法则像楼梯,三个水平无数级,从大到小逐层找,推理验证需要多方面进行。

当我们选好明星分子以后,调控层次就是要考虑的问题了,这里说的调控层次就是围绕中心法则展开对明星分子本身的探索,我们知道中心法则涉及到DNA-RNA-蛋白三个层面,根据调控的层次一般我们又分为转录水平和转录后水平,转录我们知道是发生在细胞核里面的。所以我们看到某个分子定位在细胞核时我们一般就从转录水平进行考虑,比如转录因子对DNA序列的结合,DNA甲基化、组蛋白修饰等等,而当RNA被转录出来后要经过加工过程,比如可变剪接,miRNA介导的降解,mRNA翻译成蛋白,蛋白合成后会被磷酸化修饰或者泛素化修饰从而激活或者降解等等,这些是转录后的水平。那么我们在确定明星分子后,一般来说需要首先确定的是变化发生在哪个层面,是RNA还是蛋白,是蛋白的产生(翻译)、降解(比如泛素化)还是活化(比如磷酸化),从而把研究的焦点集中到明星分子的某个过程,这个层面是围绕一个明星分子的前世今生来展开的。


4、工具分子
一个结果多个因素,工具分子一大群,具体哪个有作用,一般情况用免疫沉淀IP来验证准确性。

确定了明星分子在哪个层面被调控后,就要找相应的工具分子了,工具分子是指像酶(比如激酶、泛素酶、甲基化酶)、转录因子、翻译因子、剪接因子等为主的一系列蛋白,每个系列的工具分子一般都有很多,比如泛素酶就有成百上千个,那具体是哪一个导致明星分子被泛素化呢?以免疫沉淀(IP)技术为基础延伸出来的各种分子就是用来找这类工具分子的最常用策略,比如通过IP加质谱鉴定与明星分子作用的泛素化酶,通过RNA pulldown加质谱鉴定与RNA结合的工具蛋白(如翻译因子和剪接因子),通过RIP-seq来寻找与蛋白结合的RNA,通过ChIP-Seq来寻找与蛋白结合的DNA序列(如靶基因)等等。找到工具分子后,作用的信号轴就有了:某基因(因素)通过(4)工具分子从(2)明星分子(3)某个层面调控(1)某条信号通路。

5、 具体位点
分子整体有作用,具体位点讲不清,可以拆开组合来验证。

这一步就是要进一步把明星分子和工具分子进行拆解,工具分子揍了明星分子一顿,具体是揍了一拳还是踢了一脚,工具分子的一拳打在了明星分子的脸上还是肚子上,这个是两个要交代清楚的问题,所以就要把工具分子和明星分子中发挥功能的位点、序列或者结构域找到,找到后就可以更加清楚的描述了:工具分子左拳打在了明星分子头上,具体位置是打在了太阳穴上,把明星分子打死了,这样导致一个以明星分子为中心的网络(信号通路)出现崩溃或者瘫痪,异常(疾病)就出现了。所以我们在文章中常常看到要把蛋白根据结构域进行分段,把RNA根据序列长度进行分段,然后再看他俩之间还有没有作用。


三、分子机制研究的五个层次
层次一:相关性;一般对应的文章分数在1-3分左右;
层次二:因果关系;一般对应的文章分数在3-5分左右;
层次三:直接作用;一般对应的文章分数在5-10分左右;
层次四:嵌套组合;一般对应的文章分数在10-20分左右;
层次五:观念创新;文章的层次是CNS级别。

 

1、层次一:相关性
两个因素的相关性是做机制研究的第一层关系,也是最弱的关系。这里的因素可以是药物、基因、现象等等,比如基因A的表达水平与肝癌肿瘤病人的预后、药物的浓度与细胞凋亡的比率等等。对于疾病的研究来说,如果某因素与疾病进展或者预后有强相关性,就可能把该因素作为疾病进展或者预后的marker,比如甲胎蛋白AFP之于肝癌,所以有一类研究称之为伪基础研究,研究的名字比如:Prognostic Significance of gene A expression in B disease. 或者Association between gene A and B disease.

相关性是最弱的逻辑联系,因为两个因素之间存在相关性有可能是完全没有逻辑的,比如北京的房价与肺癌的发病率之间的相关性。

2、层次二:因果关系
在相关性的基础上深入的一层关系是因果关系,即因果关系是相关性的子集。如果A基因表达或者突变与B疾病之间存在相关性,那么有可能把A因素作为B疾病的biomarker;如果A基因是B疾病的原因,那么可以通过干预A基因影响B疾病进展。
  1)在分子机制研究中,因果关系的存在是要证明的第一步,比如在进行某中药通过AMPK信号通路抑制细胞增殖的研究中,为了说明某中药调控AMPK信号通路,我们最常规的手段就是通过WB检测AMPK信号通路以及下游分子的表达或者活化状态,就是证明中药Z剂量与AMPK通路分子表达的因果关系。
  2)为了证明因果关系的第二个部分就是挽救实验,即如果上调A因素导致了B结果的出现,对A因素的下调是否可以逆转B结果的出现。

3、层次三:直接作用
承接第二个层次,如果A因素是导致B结果出现的原因,那么A因素是直接原因呢还是间接原因?对应到分子机制研究中就是这样:A基因的上调导致了B蛋白的磷酸化,那么A基因直接与B相互作用介导的(直接作用)还是通过C介导的呢?
  1)为了证明这一点,通常用分子间的直接作用来验证,比如蛋白与蛋白作用的co-IP,GSTPulldown,蛋白与RNA作用的RIP、RNApulldown,蛋白与DNA作用的CHIP、EMSA等等,就是为了判断两者之间的直接还是间接作用。
  2)在以分子为单位的研究中,第二部分就是“分子局部”研究,比如已经证明了蛋白A与RNA B是直接结合的,“分子局部”研究就是确定蛋白A的什么局部(哪些氨基酸形成的结构域)与RNA B的哪段序列直接结合。
做到这一步,绝大多数分子研究的深度就够了,即使是最顶级CNS级别的文章要求也不过如此。

4、层次四:嵌套组合
既然第三层次分子机制的研究深度已经够CNS级别的文章了,第四层次就不仅仅是研究深度的问题了,而是故事的丰富度,有一个观点就是从第三层次到第四层次的升级:单线到多线的过渡,即把几个第三层次的单线研究嵌套组合为一个故事,第三层次要求把一个故事的一条线讲清楚,第四层次要求把一个故事的多条线讲清楚,而多条故事线的汇总形式有很多:比如双头蛇模式、反馈回路模式等等。

比如在第三层次的研究中,已经通过各种实验证明了lncRNAA通过抑制蛋白B的降解上调B的表达,在第四层次中双头蛇模式是:lncRNAA 除了通过抑制蛋白B的降解上调B的表达(层次三),还可以通过ceRNA的方式下调microRNAC表达从而促进B的表达;反馈回路模式则是:lncRNAA除了通过抑制蛋白B的降解上调B的表达(层次三),而上调表达的蛋白B促进了lncRNAXXX的转录,从而形成正反馈回路。

5、层次五:观念创新
层次五就是最高层次,即观念层面的创新,一般到这个层次就是CNS级别了,比如新现象的发现、两个貌似没有关系的现象之间联系的揭示等,这点大家看CNS的文章应该有感触,举个例子:外泌体的形成与细胞自噬之间有没有关系呢?

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