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细胞焦亡整体实验

 
1、提供细胞焦亡整体实验方案:客户根据课题标书及需做实验的主体内容,拟定并提供初步的项目方案,含课题申请书,实验方案,实验设计,实验思路,实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成细胞焦亡整体实验方案的设计。
2、项目评估报价:公司技术团队根据客户提供的相关资料,综合评估项目可行性,与客户共同确定准确的实验项目执行方案,给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。
3、签订服务协议:签署服务协议并预付部分费用,做好实验初步准备及项目预安排。
4、执行服务项目:正式启动实验进程,全面展开实验,确保项目有效执行。
5、沟通项目进展:及时沟通反馈实验的最新进展,随时了解掌控实验的最新动态。
6、完成项目交付:支付剩余尾款,交付实验结果,正确应用实验结果,提供售后服务。

 


 
一、细胞焦亡介绍
程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD),是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后,为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。凋亡、自噬、细胞程序性坏死、细胞焦亡都是是程序性死亡的表现形式。

细胞焦亡(pyroptosis)
是一种最近发现的细胞程序性死亡方式,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体重要天然免疫反应,在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。相比于细胞凋亡(apoptosis),细胞焦亡发生的更快,依赖于半胱天冬酶-1(caspase-1),并会伴随大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。细胞焦亡本质上是由GSDMD(gasdermin D)蛋白介导的细胞炎性坏死,与多种病理生理过程紧密相关。一旦发生,GSDMD 蛋白的 N - 端高聚并与脂类结合,在细胞膜上形成孔洞,细胞逐渐膨胀至细胞破裂,最终大量细胞内含物如 IL-1β释放,激活强烈的炎症反应。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展,对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。细胞焦亡
主要通过炎症小体介导包含Caspase-1在内的多种Caspase的激活,造成包括GSDMD在内的多种Gasdermin家族成员发生剪切和多聚化,造成细胞穿孔,进而引起细胞死亡。相比于细胞凋亡(apoptosis),细胞焦亡发生的更快,并会伴随着大量促炎症因子的释放。

细胞发生焦亡时,细胞会发生肿胀,在细胞破裂之前,细胞上形成凸出物(图A),之后细胞膜上形成孔隙,使细胞膜失去完整性,释放内容物,引起炎症反应,此时,细胞核位于细胞中央(图B),随着形态学的改变,细胞核固缩,DNA断裂。

 

 
 
二、细胞焦亡信号通路
分为依赖Caspase-1的经典途径依赖Caspase-4、5、11的非经典途径。

1、依赖Caspase-1的经典途径
在细菌,病毒等信号的刺激下,细胞内的模式识别受体作为感受器,识别这些信号,通过接头蛋白ASC与Caspase-1的前体结合,形成多蛋白复合物,使Caspase-1活化,活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D,形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段,诱导细胞膜穿孔,细胞破裂,释放内容物,引起炎症反应;另一方面,活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并释放到胞外,募集炎症细胞聚集,扩大炎症反应。

 
2、依赖Caspase-4、5、11的非经典途径
在细菌等信号的刺激下,Caspase-4、5、11被活化,活化的Caspase-4、5、11切割Gasdermin D,形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段,一方面诱导细胞膜穿孔,细胞破裂,释放内容物,引起炎症反应;另一方面,诱导Caspase-1的活化,对IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并释放到胞外,募集炎症细胞聚集,扩大炎症反应。


 
三、细胞焦亡的检测方法
1、形态变化
  1)扫描电镜观察细胞形态
  2)TUNEL染色
  3)免疫荧光染色(GSDMD/GSDME)

2、检测焦亡相关蛋白
  1)q-PCR/Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平(例如,Caspase-1、4、5、11;GSDMD ; CleavedCASP-3等)

 

 
  2)ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-18等炎症因子的水平
  3)MTT法测定细胞活力

四、细胞焦亡的研究领域
细胞焦亡是机体重要的免疫反应,在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用。广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。
1、细胞焦亡与感染性疾病
在病原体感染时,适度的细胞焦亡可清除致病微生物,而过度的细胞焦亡在导致细胞死亡的同时,释放炎症因子,扩大炎症反应,造成发热,低血压、败血症等症状。以败血症为例,败血症是由致病菌侵入血液系统,并在其中生长繁殖,产生毒素,引起全身性感染,最新研究表明,细胞自噬相关基因Atg7沉默后,可激活细胞焦亡途径。


 
2、细胞焦亡与代谢性疾病
因代谢障碍或代谢旺盛等原因引起的疾病称为代谢性疾病,常见的有糖尿病、痛风、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病为例,由心肌细胞死亡引起,最新的研究显示高血糖可以造成活性氧的产生增加,进而上调NF-κB和TXNIP,NF-κB又可以上调NLRP3、IL-1β前体以及IL-18前体的表达;TXNIP通过改变NLRP3的结构激活Caspase-1,活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D,形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段,诱导心肌细胞膜穿孔、破裂,释放内容物,引起炎症反应;另一方面,活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并释放到胞外,募集炎症细胞聚集,扩大炎症反应。


 
3、细胞焦亡与神经系统疾病
神经系统疾病包括脑损伤,癫痫等。以癫痫为例,研究发现,癫痫发作可通过钾离子外流等途径激活NLRP1炎症体,进而激活依赖Caspase-1的焦亡途径,导致癫痫进一步发展。

 

 
4、细胞焦亡与动脉粥样硬化
在动脉粥样硬化的发展中,炎症被认为是启动和驱动动脉粥样硬化的主要因素。在高血脂、氧化修饰的低密度脂蛋白等几次下,激活Caspase-1,介导血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的焦亡与炎症反应,导致血管扩张功能障碍、坏死中心的形成,粥样硬化斑块的稳定,最终造成动脉粥样硬化。

 

 
5、细胞焦亡与肿瘤
研究发现,在ROS及细胞毒素的作用下,JNK激酶被激活并转移到细胞核内,促进焦亡相关基因的表达,启动焦亡的形成,控制肿瘤的发展。

 

 
五、各种程序化坏死包括细胞焦亡的区别

  细胞凋亡 细胞自噬 细胞坏死 细胞焦亡
相同点 都是程序性坏死方式
诱因 生理条件下的基因调控 营养缺乏或激素诱导 病理性变化或剧烈损伤 病理性刺激
细胞形态 缩小 产生空泡 细胞膨大,变形 细胞膨大,变形
细胞膜 膜结构完整 膜结构完整 细胞膜破裂 细胞膜破裂
细胞器 完整 被自噬体吞噬,最终被溶酶体消化 变形或肿大 变形
DNA 降解为180-200bp及其整数倍的片段 随机降解 随机降解 随机降解

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