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嘉美实验中心普外科研究实验外包服务


普外科科研包括:肝脏外科、胰腺外科、胆道外科、胃肠道外科、血管外科、甲状腺外科、乳腺外科、重症科、器官移植、门脉高压症、营养学科等相关科室及疾病的病理、机制、治疗等的研究。
 
嘉美实验给普外科,各专家教授、硕博研究生……

提供全方位的实验解决方案,包括实验设计以及实验外包服务。


嘉美实验中心普外科课题:研究最多的疾病或研究
 
1、普外科研究最多的疾病:肝脏缺血再灌注、肝纤维化、肝损伤、脂肪肝(NAFLD/AFLD)、急性胰腺炎、同型半胱氨酸血症、肝移植、肝硬化、门脉高压症、自身免疫性肝炎、肝衰竭、胆固醇结石、胆道闭锁、乳腺癌、肝癌、甲状腺癌、胰腺癌、三阴性乳腺癌……
 
2、普外科研究最多的细胞:Kupffer细胞、肝星状细胞(HSC)、树突状细胞、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞17(Th17)、辅助性T细胞1(Th1)、NK细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、中性粒细胞、枯否细胞、胰腺腺泡细胞、肝细胞、肝窦内皮细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、甲状腺癌细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、髓源性抑制细胞(MDSCs)、甲基转移酶……
 
3、普外科研究最多的蛋白或基因:PD-1/PD-L1、泛素化及相关、转录因子、MyD88、Beclin-1、各类Toll样受体、钙离子(Ca2+)、SIRT1、P53、STAT3、MAPK、TGF-β1、ERK1/2、Wnt、miR-34a、miR-146、miR-206、miR-330、SphK1、miR-192、mTOR、β-catenin、NF-κB、HIF-1α、NLRP3、AKT、PI3K、PTEN、MALAT1、Smad、TGF-β、JNK、Notch、整合素、IL-17、MIF、FOXP3、CXCR4、COX……
 
4、普外科研究最多的方向:信号通路、细胞自噬、铁死亡、细胞焦亡、外泌体、miRNA/LncRNA/CircRNA、线粒体、免疫耐受、肠道菌群、EMT、内质网、氧化损伤、氧化应激、溶酶体、甲基化、程序化坏死……
 
 
嘉美实验中心提供          ———— 普外科研究成果展示 ————
 
1、普外科在细胞焦亡方向的研究成果
  ① 紫茎泽兰通过ROS-NLRP3调控细胞焦亡诱导小鼠肝毒性
  ② caspase-3对GSDME的调控在洛铂诱导的结肠癌细胞焦亡中作用

2、普外科在细胞铁死亡方向的研究成果
  ① Rsl3通过gpx4失活和ROS形成诱导铁大肠癌细胞铁死亡
  ② 缺血诱导的ACSL4激活铁死亡介导肠缺血/再灌注时组织损伤

3、普外科在自噬 + 外泌体方向的研究成果
  ①外泌体通过抑制Beclin1介导的自噬缓解肝脏纤维化

4、普外科在miRNA/circRNA/LncRNA方向 + 外泌体方向的研究成果
  ① 脂肪细胞外泌体circRNA通过靶向去泛素化相关基因促进肝细胞癌的生长
  ② lnRNA 通过调节某基因来促进肝细胞癌外泌体分泌
  ③ 某基因修饰的骨髓间充质干细胞的外泌体某miRNA的siRNA抑制肝细胞癌中索拉非尼的耐药性

5、普外科在干细胞 + 外泌体研究方向的研究成果
  ① 肿瘤干细胞样细胞衍生的外泌体激活中性粒细胞促进结肠癌发生
  ② 人脐带间充质干细胞的外泌体抑制胰腺导管腺癌进展

6、普外科在巨噬细胞 + 外泌体 + 缺氧诱导 + 信号通路研究方向的研究成果
  ① 巨噬细胞分泌外泌体促进胰腺癌抵抗吉西他滨
  ② 受损的肝脏释放的外泌体通过激活肺泡巨噬细胞信号通路引发急性肺部炎症
  ③ 缺氧诱导的外泌体通过某通路介导M2巨噬细胞极化以促进胰腺癌转移

相关文献
1、Sun W, Zeng C, Liu S, Fu J, Hu L, Shi Z, Yue D, Ren Z, Zhong Z, Zuo Z, Cao S, Peng G, Deng J, Hu Y. Ageratina adenophora induces mice hepatotoxicity via ROS-NLRP3-mediated pyroptosis. Sci Rep. 2018 Oct 30;8(1):16032.
2、Yu J, Li S, Qi J, et al.Cleavage of GSDME by caspase-3 determines lobaplatin-induced pyroptosis in colon cancer cells[J]. Cell Death Dis. 2019 Feb 25;10(3):193.
3、Sui X, Zhang R, Liu S, RSL3 Drives Ferroptosis Through GPX4 Inactivation and ROS Production in Colorectal Cancer[J]. Front Pharmacol. 2018 Nov 22;9:1371.
4、Li Y,Feng D,Wang Z,Zhao Y,Sun R,Tian D,Liu D,Zhang F,Ning S,Yao J,TianX.Ischemia-induced ACSL4 activation contributes to ferroptosis-mediated tissue injury in intestinal ischemia/reperfusion. Cell Death Differ. 2019 Feb 8. doi: 10.1038/s41418-019-0299-4. [Epub ahead of print]
5、Chen, J., et al. (2017). "MicroRNA-30a ameliorates hepatic fibrosis by inhibiting Beclin1-mediated autophagy." J Cell Mol Med. IF=4.499
6、Zhang, H., et al. (2018). "Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7." Oncogene.  IF=6.854
7、Yang, L., et al. (2019). "Long non-coding RNA HOTAIR promotes exosome secretion by regulating RAB35 and SNAP23 in hepatocellular carcinoma." Mol Cancer 18(1): 78. IF=7.776
8、Li, H., et al. (2018). "Exosomes derived from siRNA against GRP78 modified bone-marrow-derived mesenchymal stem cells suppress Sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma." J Nanobiotechnology 16(1): 103.  IF=5.294
9、Hwang, W.L., Lan, H.Y., Cheng, W.C., Huang, S.C., and Yang, M.H. (2019). Tumor stem-like cell-derived exosomal RNAs prime neutrophils for facilitating tumorigenesis of colon cancer. Journal of hematology & oncology.  IF=7.333
10、Ding, Y., et al. (2018). "Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stromal cells deliver exogenous miR-145-5p to inhibit pancreatic ductal adenocarcinoma progression." Cancer Lett 442: 351-361.  IF=6.491
11、Yoav Binenbaum, et al. Transfer of miRNAin macrophages-derived exosomes induces drug resistance of pancreatic adenocarcinoma.Cancer Research, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-0124
12、Wang, Y., et al. (2019). "Injured liver-released miRNA-122 elicits acute pulmonary inflammation via activating alveolar macrophage TLR7 signaling pathway." Proc Natl Acad Sci U S A116(13): 6162-6171.  IF=9.504
13、Wang X, Luo G, Zhang K, et al. Hypoxic tumor-derived exosomal miR-301a mediates M2 macrophage polarization via PTEN/PI3Kγ to promote pancreatic cancer metastasis[J]. Cancer Res, 2018,78:4586-4598.


嘉美实验中心提供    ———— 普外科各研究方向国自成果展示 ————
 

1. 普外科研究线路一:
(1) 某蛋白or基因 + 调控/介导某信号通路 + 某疾病的机制研究
(2) 相关的国自课题有:
  ① FGF21调控ATF6/eIF2α/CHOP信号通路介导内质网应激肝损伤的分子机制研究,2018
  ② STREX调控BKCa通道活性参与Oddi括约肌功能紊乱的机制研究,2018
  ③ microRNA-34a/SIRT1信号调控在原发性硬化性胆管炎中的作用及其机制研究,2018
  ④ SPD介导的Notch信号通路调控急性胰腺炎胰岛β细胞损伤后分化及再生的机制研究,2018
  ⑤ Circ0006969-miR18a-mTOR通路轴调控乳腺肿瘤干细胞耐药的机制研究,2018
  ⑥ LncRNA/VPS9D1-AS1调控TGF-β信号通路促进结直肠癌细胞增殖和迁移的作用及其调控机制研究,2018
  ⑦ HIF-1α/mTORC1信号轴对跨区穿支皮瓣内血管新生的影响及其机制,2018
 
2. 普外科研究线路二:
(1) 小RNA + 调控某蛋白/基因/通路 + 某疾病的机制研究
(2) 相关的国自课题有:
  ① 环状RNA调控干扰素-γ基因甲基化参与胆道闭锁发病的分子机制,2018
  ② LncRNA-BC090353调控IL6表达对胆道闭锁肝内胆管增生机制研究,2017
  ③ Lnc-PFAR调控pre-miR-141成熟激活自噬促进慢性胰腺炎纤维化的机制研究,2018
  ④ CircRNA;XPO4作为ceRNA调控三阴乳腺癌顺铂耐药的作用和机制研究,2018
  ⑤ 环状RNA调控RBM8A活性抑制肝素酶蛋白翻译对胃癌侵袭转移的作用及机制研究,2018
  ⑥ MiRNA/lncRNA/circRNA/tRF调控BIRC5基因异常表达抑制胃癌细胞凋亡及促进耐药的分子机制研究,2018
 
3. 普外科研究线路三:
(1) 外泌体(miRNA/LncRNA/CircRNA /其他) + 调控/介导/降解某蛋白/基因/细胞等 + 某种疾病的机制研究 
(2) 相关的国自课题有:
  ① 肝细胞外泌体lncRNA调控HSC自噬及EMT促进肝纤维化的机制研究,2018
  ② 胃癌细胞来源外泌体miR-519a-3p通过抑制肝Kupffer细胞Lefty1分泌以促进肝转移灶形成的机制研究,2018
  ③ 外泌体介导的TCTP蛋白促进胆囊癌侵袭转移的分子机制及其干预研究,2018
  ④ 乳腺癌转移灶内CAF通过外泌体调控乳腺癌干细胞间质-上皮转化的机制研究,2018
  ⑤ 肿瘤细胞来源外泌体miRNA调控巨噬细胞极化参与胰腺癌化疗敏感性研究,2018
  ⑥ 外泌体诱导T淋巴细胞失衡在自身免疫甲状腺炎发病中的研究,2017
  ⑦ PG490联合FK506通过肥大细胞外泌体对异体大鼠后肢移植术后免疫调节机制研究,2018
 
4. 普外科研究线路四:
(1) 某蛋白/基因 + 调控or介导自噬等 + 某种疾病的机制研究 
(2) 相关的国自课题有:
  ① NF-κB/miR-29b/HMGB1通路调控肝星状细胞自噬影响肝纤维化的机制研究,2018
  ② LncRNA MEG3/miR-21通过LAMP-2介导自噬流受阻引起程序性坏死加重急性胰腺炎分子机制研究,2018
  ③ 12HETE/GPR31通路调控自噬在三阴性乳腺癌肿瘤干细胞干性维持中的作用,2018
  ④ Sirt3介导线粒体自噬在原发性胆汁性胆管炎免疫损伤中的作用及机制研究,2018
  ⑤ LncRNA-NONRATT014386调控Tubb3基因在多氯联苯致甲状腺细胞自噬损伤中的机制研究,2016
 
5. 普外科研究线路五:
(1) 肠道菌群变化/代谢 + 某蛋白或基因等 + 某种疾病的机制研究 
(2) 相关的国自课题有:
  ① 肠道菌群代谢产物丁酸钠通过HDAC2调控肝脏GLP-1抵抗改善NASH机制研究,2018
  ② 肠道菌群靶向卵磷脂代谢激活GPR4炎症信号轴在肝硬化“肠-肝串扰”中的作用及机制研究,2018
  ③ DOT1L基因与肠道菌群在大肠癌发生发展中的网络关系,2018
  ④ 基于肠道菌群调控肠道NLRP3炎症小体激活探讨重症急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤机制 ,2017
 
6. 普外科研究线路六:
(1) 某蛋白/基因/外泌体等 + 调控/介导/抑制/诱导某细胞焦亡 + 某种疾病的机制研究 
(2) 相关的国自课题有:
  ① lncRNA-GAS5/NLRP3/Caspase-1途径介导的肝细胞焦亡在肝纤维化中的作用及其机制研究,2018
  ② lncRNAENST-hnRNPU-GSDMD轴抑制细胞焦亡在乳腺癌化疗耐药中的作用及机制研究,2018
  ③ LPS诱导巨噬细胞释放包含HMGB1外泌体引起肝细胞焦亡在肝衰竭中的机制研究,2018
  ④ Stat5调控NLRP3诱导细胞焦亡招募MDSC介导胰腺炎癌转化的机制,2018
  ⑤ 索拉非尼激活NLRP3炎性体诱导肝癌细胞焦亡的机制研究,2017
 
7. 普外科研究线路七:
(1) 某蛋白/基因/外泌体等 + 调控/介导/抑制/诱导某铁死亡 + 某种疾病的机制研究 
(2) 相关的国自课题有:
  ① NDRG2调控胆管癌细胞铁死亡(Ferroptosis)抑制肿瘤生长及增敏化疗与靶向治疗的机制研究,2018
  ② c-Met通过激活NRF2抑制细胞铁死亡(ferroptosis)促进肝癌瑞戈非尼耐药的机制研究,2018
  ③ SPINK4调控结肠癌细胞铁死亡的作用机制研究,2018
  ④ 睡眠碎片化抑制GPX4诱导铁死亡导致术后谵妄的机制研究,2018


嘉美实验中心提供    ———— 普外科课题常用研究方法 ————
 
1. 研究对象:
  (1) 动物实验:构建动物模型,通过中、西药,小分子,病毒载体,外泌体,蛋白,抗体,手术,物理手段等等方法进行治疗。观察动物临床状况,收集动物标本进行病理检测,电镜,蛋白、基因检测,生化指标检测,测序芯片等检测。
  (2) 细胞实验:原代细胞,我们先进行原代细胞分离;细胞株进行细胞复苏,再根据实验分组进行预药干预、转染、低氧常氧、射线处理等各种细胞培养。最后进行各种实验检测:电镜、激光共聚焦检测、Hochest细胞染色流式细胞表型、CD分子检测、细胞周期检测、Transwell迁移与侵袭实验、细胞趋化实验细胞划痕(修复)、实验细胞克隆(集落)形成实验、小管形成实验、细胞粘附能力检测、细胞增殖/毒性MTT/CCK8实验、细胞线粒体膜电位MMP检测、细胞内钙离子检测、WB和PCR方法对各蛋白、基因检测等等。
  (3) 临床标本:医院客户收集临床标本,根据需求进行各种检测。
 
2. 细胞凋亡:
  (1) 早期凋亡(膜凋亡)检测:用流式细胞法,Annexin V/PI双染试剂盒进行检测。
  (2) 原位末端凋亡(Tunel)检测:用免疫组化及荧光方法,Tunel试剂盒进行检测。
  (3) 凋亡相关蛋白检测:用WB或者流式方法检测,有些蛋白会用到ELISA的方法。
 
3. 细胞焦亡:
  (1) 形态变化 
   ① 扫描电镜观察细胞形态
   ② 扫描电镜观察细胞形态:细胞发生焦亡时,细胞会发生肿胀,在细胞破裂之前,细胞上形成凸出物,之后细胞膜上形成孔隙,使细胞膜失去完整性,释放内容物,引起炎症反应,此时,细胞核位于细胞中央,随着形态学的改变,细胞核固缩,DNA断裂。
   ③ 免疫荧光染色(GSDMD/GSDME)
  (2) qPCR/Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白Caspase-1,4,5,11,IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-8,GSDMD,GSDME,Cleaved Caspase-1,3等的表达水平。
  (3) ELISA或Luminex或CBA多因子方法检测外周血或者细胞培养上清液种IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的水平。
  (4) MTT法测定细胞活力
 
4. 铁死亡的检测
  (1)新陈代谢
   ①细胞活性:CCK-8;
   ②细胞内铁水平:可以使用PGSK探针检测,通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料,结果表明,在铁死亡的细胞中,PGSK的绿色荧光会减弱;
   ③活性氧的水平:通过C11-BODIPY探针检测,在铁死亡细胞中,探针会由红色转化为绿色;
   ④QPCR/Western Blot:检测细胞内与铁死亡相关的因子的变化,例如COX-2,ACSL4,PTGS2,NOX1,GPX4和FTH1等,其中COX-2,ACSL4,PTGS2和NOX1在铁死亡细胞中表达上调;GPX4和FTH1在铁死亡细胞中表达下调
  (2)形态观察
   ①透射电镜直接对细胞形态进行观察:细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大;
   ②线粒体膜电位检测:通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例;
   ③线粒体形态观察:向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白,一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态。

5. 自噬的检测
  (1) 细胞自噬过程的观察和检测方法
   ① 正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,必须对自噬进行人工干预和调节。
   ② 细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
    1) 观察自噬体的形成;
    2) 在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成;
    3) 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成;
    4) 检测长寿蛋白的批量降解;
    5) MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色;
    6) CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。
  (2)在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位。
   ① Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。
   ② LysoTrackerTM 探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。
   ③ pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。
   ④ MitoTraker探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。
   ⑤ Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。
   ⑥ Calreticulin(钙网织蛋白):内质网腔
  (3) 自噬相关蛋白和基因检测
   ① 抑制类通路相关蛋白基因检测
    1) Class I PI3K pathway (PI-phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)与IRS (Insulin receptor substrate) 结合,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高抑制自噬)
    2) mTOR pathway(mammalian target of rapamycin)mTOR在人类中的同源基因是FRAP1(FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号,如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂。
  ② 激活类通路相关蛋白基因检测:Class III PI3K,结构上类似于Class I PI3K,但作用相反。
  ③ 自噬标志物蛋白检测:Beclin-1、Lamp-1、Lamp-2、LC3。

6.外泌体
(1) 外泌体分离
嘉美实验中心使用Thermo旗下Invitrogen公司的Total Exosome Isolation Reagent系类试剂盒分离外泌体。
 


 
① Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)用于细胞的外泌体分离
② Total Exosome Isolation Reagent (from serum)用于血清的外泌体分离
③ Total Exosome Isolation Kit (from plasma)用于血浆的外泌体分离
④ Total Exosome Isolation Reagent (from urine)用于尿液的外泌体分离
⑤ Total Exosome Isolation Reagent (from other body fluids)用于体液的外泌体分离
(2)外泌体鉴定
① 电镜
 




 
② WB检测外泌体标志物


 
③ FCM流式检测外泌体标志物


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