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荧光素酶报告基因实验

一、荧光素酶报告基因实验介绍
荧光素酶报告基因(luciferase)是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素(oxyluciferin),在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。因子,研究者利用荧光素酶开发出一套极其灵敏且使用方便的基因报告系统。目前这一系统被广泛用于转录因子结合位点与启动子活性分析、RNA降解、信号转导、药物筛选、动物活体成像等领域。

二、荧光素酶报告基因实验用于启动子活性的研究
某些转录因子与其靶启动子中的特异序列结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用,荧光素酶报告基因实验(luciferase report assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
 
 
三、基因3’UTR区和microRNA结合实验
由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用,可以将目的基因3’UTR区域构建至报告基因luciferase的后面, 通过比较过表达或者干扰miRNA后,报告基因表达的改变(监测荧光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用;结合定点基因突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
 
 
四、嘉美实验常用的载体有两种策略
第一种是两种荧光素分别位于两个载体上,第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。

1、以第一种为例,这两种载体分别为pMIR-REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经检索发现,pMIR-REPORT miRNA载体是由Ambion开发的载体,它用来克隆插入miRNA靶序列,评估细胞内miRNA功能的载体,该载体的图谱如下所示:
 
 
 
 
另外的一个载体是pRL-TK载体,这个载体是由Promega开发的,pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体,含有SV40增强子,质粒图谱如下所示:
 
从这两个图谱中可以发现,pMIR-REPORT miRNA这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合,靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面,这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶,而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶,将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时,pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。
 
2、第二种方案就是将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上,这样偏差更小,毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易,在这方面,根据检索到的资料显示,现在的这类质主要有Promega公司的pmirGLO质粒,图谱如下所示:
 
 
另外的质粒是pEZX-MT06质粒,图谱如下所示:
 
 
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