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微小miRNA荧光定量PCR检测

 

 
 
一、MiRNA介绍
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA 分子。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。MicroRNA存在多种形式,最原始的是pri-miRNA,长度大约为300~1000个碱基;pri-miRNA经过一次加工后,成为pre-miRNA即microRNA前体,长度大约为70~90个碱基;pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后,成为长约20~24nt的成熟miRNA。
 
二、实验验技术简介
MicroRNA是长片段RNA序列的一部分,短小的非编码的单链RNA,由大约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来,通过与目标mRNA的3′端非编码区域(3’-untranslated region,3’-UTR)互补。Northern blot分析的灵敏度低、通量差仍是其主要不足。实时定量PCR由于其灵敏度高、方便快速成为检测的一个不错选择。

三、实验技术原理
由于成熟的miRNA仅为21-23 nt,不能通过传统方法进行发转录,进而进行定量。可设计反转录引物与成熟miRNA结合,形成反转录引物/成熟miRNA复合物,并在miRNA的5’末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子,为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。

四、实验操作流程
1、提取样本中的RNA
2、反转录
3、荧光定量PCR
 
 

 

五、实验注意事项
1、客户提供检测样本(组织或细胞);或纯化好的RNA。
2、提供熔解曲线、扩增曲线等图片。
2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)。
 
具体实验咨询,请联系嘉美实验


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