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双向电泳实验


双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的组合,即先进行等电聚焦电泳(根据蛋白质等电点进行分离),然后再进行SDS-PAGE(根据蛋白质分子大小进行分离),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。

通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中(φ1~3 mm)中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中,结合 SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。
 

实验技术简介:双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

 

实验操作流程:
1、样本制备
2、固相预制胶条水化
3、第一向等电聚焦(IEF)
4、胶条平衡
5、第二向SDS-PAGE电泳
6、凝胶染色检测
7、图片扫描

 


实验注意事项:
客户提供:

1、原样(组织、细胞、菌体等)湿重不少于200mg。
2、蛋白提取物,浓度不少于4ug/ul,总量不少于5mg。 
3、寄样须知:样品需低温保存,用干冰保存快递 。

交付标准:
1、双向电泳电子图片及定量分析结果,包括差异点号码、差异倍数。
2、差异点的一级质谱或二级质谱峰图,质谱鉴定结果,包括pI和MW等。
3、双向电泳完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。



 
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