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凝胶电泳迁移EMSA实验

 

 
一、凝胶迁移或电泳迁移率实验介绍
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN**段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
 
二、探针的标记
1、如下设置探针标记的反应体系:
  1)待标记探针 (1.75 pmol/微升) :2微升。
  2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1微升。
  3)Nuclease-Free Water :5微升。
  4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1微升。
  5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1微升。
  6)总体积 10微升
  7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。

2、 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。
 
3、加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。
 
4、再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。

5、标记好的探针**立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
 
二、 探针的纯化
通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作:
1、对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。
2、在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。
3、在4℃,12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。
4、在4℃,12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。
5、加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针**立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
 
三、EMSA 胶的配制
1、准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。**选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
2、按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
  1)TBE buffer (10X): 1毫升。重蒸水 16.2毫升。
  2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2毫升。
  3)80% 甘油: 625微升。
  4)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) :150微升。
  5)TEMED :10微升
3、按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
 
 

 
四、EMSA结合反应
1、如下设置EMSA结合反应
阴性对照反应:
  1)Nuclease-Free Water :7微升。
  2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。
  3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 0微升。
  4)标记好的探针 :1微升。
  5)总体积 :10微升。
样品反应:
  1)Nuclease-Free Water :5微升。
  2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。
  3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。
  4)标记好的探针: 1微升。
  5)总体积: 10微升。
探针冷竞争反应:
  1)Nuclease-Free Water :4微升。
  2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。
  3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2微升。
  4)未标记的探针: 1微升。
  5)标记好的探针: 1微升。
  6)总体积 :10微升。
突变探针的冷竞争反应:
  1)Nuclease-Free Water :4微升。
  2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。
  3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2微升。
  4)未标记的突变探针: 1微升。
  5)标记好的探针: 1微升。
  6)体积 :10微升
Super-shift反应:
  1)Nuclease-Free Water:4微升。
  2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2微升。
  3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2微升。
  4)目的蛋白特异抗体 :1微升。
  5)标记好的探针:1微升。
  6)总体积 :10微升。
 
2、按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。
 
3、加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。
 
五、 电泳分析
1、用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。

2、把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。

3、按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。

4、剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
 
5、干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。

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