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端粒酶活性检测


 

实验技术简介:近几年来端粒酶由于与长寿、癌症等的研究相关联而备受关注。 端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端,由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成,是细胞必需的遗传组分,它的作用是维持端粒有足够的长度,保证基因信息在复制过程中的准确性,以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下,每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短,当端粒短到一定程度时就会发出信号,细胞停止分裂。


端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成,是基本的核蛋白逆转录酶,在细胞染色体复制过程中,能够以自身RNA 为模板,在染色体3’末端合成重复序列,维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制,但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞,并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此,端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。

 

实验技术原理:
利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性,采用PCR 方法扩增此重复序列,并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法,其主要原理如下:首先合成一个18nt 的TS 做上游引物,端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG,然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列,端粒酶灭活后,加入CX 做下游引物,经过多次变性-退火-延伸,扩增端粒酶延伸产物。

 

PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理,利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带,条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点,避免了同位素的放射污染。同时,还增设了内标准物,提供阳性对照品,优化了引物设计,使PCR效果进一步提高,使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

 

实验操作流程:
1、端粒酶的提取

⑴ 手术后取下的活组织,立即保存在液氮之中;
⑵ 40~100mg 冷冻(-80%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎,研磨器研磨,加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1~2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer,悬浮细胞,涡旋振荡10s, 置冰浴中30min,每间隔数分钟涡旋振荡一次,共5-6 次;

备注:为了获取比较理想的端粒酶提取液,建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。
⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。
⑷ 移取上清,分装3-4 管,每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量,其余迅速冷冻,-80℃保存。

2、PCR 扩增
3、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳
4、银染

⑴ 将凝胶置于10%醋酸固定30min 后用蒸馏水漂洗3 次,每次5min;
⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3 次,每次30s;
⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡30min, 然后用蒸馏水漂洗30s;
⑷ 将凝胶置于显影液中显色10min 左右直到全部条带显色清晰为止;
⑸ 将凝胶置于5%醋酸中浸泡终止反应。
⑹ 选择适当时机照相。
备注:
① 硝酸银染液:0.2g AgON3、25ul 37%甲醛,定容至100ml。

② 显色液:3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠,定容至100ml。
5、使用凝胶分析软件进行结果分析

 


 

实验注意事项:
客户提供:

1、组织样品:新鲜组织放入液氮或-80度保存,组织不少于100mg;
2、培养细胞:通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80℃,避免反复冻融);
3、血液细胞标本:以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-80℃可长期保存,避免反复冻融);
4、血清或细胞培养液标本:离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(4℃可保存15-20天,-80℃可长期保存,避免反复冻融);
5、样本运输:可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后,加冰袋寄送;
细胞样本也可直接寄送培养瓶(密封保证不污染、培养液不漏出);
血清或上清液直接加冰袋寄送(送视路程远近2-3天可到达)。

交付标准:
1、图片;

2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)
其他:
1、细胞提取物中没有足够的端粒酶:在冰浴条件下制备细胞和组织提取物,尽量缩短制备时间,适当用较高浓度的端粒酶样品,减少不必要的操作。
2、端粒酶的反应时间不够:保证反应时间不少于20min。
3、所有样品和阴性对照都成阳性:PCR 残余污染。PCR 反应的每一组分勿重复使用保证使用洁净的PCR 管和PCR 试管架
4、同一种组织会有不同的端粒酶的表达活性:动物本身就有种内差,每个个体的端粒酶的表达活性情况也会不一样。 同一个体的不同组织(如睾丸/骨髓)端粒酶的表达也不一定相同。同一个体的同一组织的不同部位端粒酶的表达情况也不一定相同。
5、肿瘤组织中没有出现预期的端粒酶条带:肿瘤组织中端粒酶的表达达85%,也有部分肿瘤组织中没有端粒酶的表达,所以极少数肿瘤组织中有可能没有出现端粒酶的条带。
6、阳性对照中看不到梯度:因反复冻融会导致阳性对照中的端粒酶失活,所以应注意低温操作。
7、阴性对照里有梯度条带出现:PCR 产物、buffer A 及反应试剂等交叉污染,请将PCR 扩增产物提取区域和反应试剂配制区域分开。另外请经常使用手套。电泳上样时的交叉污染,每次上样时更换枪头。
8、由于热处理、RNase 处理不充分而引起梯度条带消失:将要使用的枪头用DEPC 水浸泡至少24 小时,再进行高压灭菌,烤干;提取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170℃烘烤5 个小时。
9、端粒酶活性不高:改善端粒酶反应条件,适当增加端粒酶反应时间,适当增加PCR 循环数(但要避免达到平台效应,使非特异性扩增大量出现),避免buffer A 的恶化,尽量减少端粒酶样品反复冻融。实验操作的指导原则是快速,低温。

具体实验咨询,请联系嘉美实验

 

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