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端粒长度检测


一、端粒介绍
端粒(Telomere)是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体,它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构,作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能,被称作细胞寿命的“ 有丝分裂钟”。端粒是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构,除了提供非转录DNA的缓冲物外,它还能保护染色体末端免于融合和退化,在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用,并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。当细胞分裂一次,每条染色体的端粒就会逐次变短一些。构成端粒的一部分基因约50~200个核苷酸,会因多次细胞分裂而不能达到完全复制(丢失),以至细胞终止其功能不再分裂。因此,严重缩短的端粒是细胞老化的信号。在某些需要无限复制循环的细胞中,端粒的长度在每次细胞分裂后,被能合成端粒的特殊性DNA聚合酶-端粒酶所保留。

二、端粒长度检测方法
实时荧光定量PCR分两部分进行,分别测定端粒和内参基因RPLPO(核糖体大亚基PO蛋白基因)的Ct值,每次反应需要设定标准曲线。端粒(T)重复拷贝数与单拷贝基因(S)的比率,即T/S比率可以得出端粒的相对长度,而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计算公式如下:   
1、基因组DNA的提取
提取人外周血基因组DNA:以试剂盒提取获得人外周血基因组DNA。   

2、实时荧光定量PCR测定DNA端粒长度  
  1)引物序列  
    端粒 Tel 1:浓度675 nmol/L   
      序列 5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’ 
    端粒 Tel 2:浓度1350 nmol/L  
      序列5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’  
    RPLPO基因 hRPLPO1:浓度800 nmol/L  
      序列5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA -3’  
    RPLPO基因 hRPLPO2:浓度800 nmol/L  
      序列5’-CAGCAAGTGG-GAAGGTGTAATCC -3’    
  2)标准曲线制作:选取同一血样基因组DNA为标准品,使用等比稀释,稀释系数为2,浓度范围为:0.25-64ng/μl,即可稀释得9个浓度梯度,分别为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25 ng/μl,制作的标准曲线R2>0.98。   
  3)反应体系:10μl反应体系(每个样设置品三个重复)  
    gDNA 10ng
    Master Mix (quantiTect SyberGreen PCR kit)  Up to 10μl
    注:内参及样品反应体系中,Master Mix 除了引物不同外,其余成分均相同   

  另一文献所述的反应体系:25μl反应体系
    SYBR Premix Ex Taq (2X)  12.5μl  
    gDNA 1.0μl (约60ng/μl) 
    端粒Tel 1  (内参基因 hRPLPO1) 0.625μl (1μl) 
    端粒Tel 2 (内参基因 hRPLPO2)  2.25μl  (1μl)  dH2O  Up to 25μl 
  4)PCR反应条件
    95℃  10 min
    95℃  15 sec 
    54℃  2 min  
    54℃检测荧光强度,35个循环
    72℃  10min

 
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