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测序

一、嘉美测序服务简介
测序指的是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达,而测序是指对基因的序列进行判断。北京嘉美实验提供DNA测序、DNA 甲基化测序、DNA 羟甲基化测序、染色质免疫共沉淀测序、microRNA测序、全基因组重测序、植物降解组测序、甲基化焦磷酸测序、转录组测序、宏基因组测序、外显子组测序、cDNA 文库构建/EST测序、动植物基因组测序等专业的测序技术服务。
 

 
二、高通量测序各平台简介
1、Hiseq 2500平台
Hiseq 2500是Illumina公司推出的一款新的高通量测序仪,测序通量可达1TB/run,一次运行可独立测试16个lane,HiSeq 2500实现了行业最高的测序产量。HiSeq 2500的测序原理和Genome Analyzer相同,采用稳定的可逆终止法边合成边测序技术。该技术使用4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链的合成,在光学系统和制造工艺方面,采用2个激光源对Flowcell进行扫描,并使用4台照相机对4种碱基分别进行记录,大幅度减少了不同碱基之间的信号干扰;同时,HiSeq 2500使用了新颖的双表面成像技术,从而提高测序产量。

2、Miseq平台
Illumina在2011年推出了个人型测序平台——MiSeq系统。MiSeq个人测序系统采用Illumina的TruSeq?边合成边测序技术。MiSeq系统特有全新的射流结构,能使试剂循环时间缩短5倍。由于时间缩短,加上试剂优化,可以达到2X250 bp的测序长度,该长度对基因组测序起了极大的推动作用。MiSeq内置了电脑显示屏及其操作界面、簇生成、测序仪、数据存储以及数据分析软件,用户无需配备其它仪器和软件。操作极简单,最终数据直接输出,特别适合医学领域和科研实验室的客户使用。

3、454平台(服务停止)
2005 年底,454 推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统—Genome Sequencer 20 System,《Nature》杂志以里程碑事件报道。2008 年 10 月,推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件。 GS FLX 系统的测序原理和 GS 20 一样:在DNA 聚合酶,ATP 硫酸化酶,荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个 dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 。通过检测荧光信号释放的有无和强度,就可以达到实时测定 DNA 序列的目的。在测序时,使用了一种叫做"Pico TiterPlate"(PTP)的平板,它含有 160-200万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。

4、ION TORRENT平台
Ion Torrent是最新推出的测序技术,它的核心技术是使用IS-FET半导体技术将生化反应与电流强度直接联系。在聚合酶反应,每聚合一个碱基,释放出氢离子,H离子的释放引起周围环境的PH变化,PH变化能够被IS-FET场效应管感应引起电流的变化,最终记录电流信号,读出AGCT的测序序列。Ion Torrent硬件设备无需激光等光学检测和CCD扫描系统,并且使用天然核苷酸和聚合酶、无需焦磷酸酶化学级联、无需标记荧光染料和化学发光的配套试剂,因此测序时间非常短、测序成本成本低,其应用范围涵盖已有高通量测序技术的应用领域,如基因组DNA测定(微生物基因组测序、线粒体测序、靶向测序)、microRNA测序、宏基因组测序、转录组测序等。
 

 
三、高通量测序样品要求
1、组织/细胞样品
请使用新鲜取样的实验材料,当场分成小块后立即用液氮或干冰乙醇速冻,保存于-80°C冰箱,用足量的干冰(根据经验,在秋冬季节,如果打包合适,3公斤块状干冰可以维持30-40小时)寄送;对于微生物样品,请客户如实声明所属物种,对于可能致病的微生物,嘉美实验保留拒收的权利;对于需要进行RNA抽提的样品,可以但不建议将组织在液氮中研磨后用TRIzol悬浮后用普通冰袋寄送,具体情况请先取得沟通。

2、环境样品
如果是新鲜土壤/污泥样品,可以以冰袋运输,不超过3天;如果是冻存过的样品(-20°C或者-80°C冰箱保存),为避免反复冻融,建议用足量的干冰(根据经验,在秋冬季节,如果打包合适,3公斤块状干冰可以维持30-40小时)寄送;如果是水体样品,建议采用滤膜过滤后,将滤膜寄送来嘉美实验。嘉美实验不负责过滤。要求滤膜3张,冰袋运输,不超过3天。其余特殊环境样品,具体咨询嘉美实验高通量测序部。

3、DNA样品
请提供电泳胶图,浓度>20 ng/μl,总量一般1~2 μg。乙醇沉淀DNA或冻干DNA,可冰袋运输,不超过3天。

4、RNA样品
请提供浓度≥750 ng/μl、总量≥2μg的总RNA样品,样品请去蛋白并进行DNase处理;请务必提供每个样品具体的浓度、体积、制备时间以及物种来源。最好附上QC数据,可以是电泳胶图、分光光度值、Nanodrop仪器检测数据或者Agilent Bioanalyzer仪器检测数据等;一般情况下,转录组测序需要Agilent Bioanalyzer仪器检测获得的总RNA 28S:18S≥1,RIN≥7;小RNA测测序不可采用常规柱式总RNA提取试剂盒,可选择传统总RNA提取法(如乙醇沉淀、异丙醇沉淀等)或者选用专门的小RNA提取试剂盒;寄送RNA样品请置于1.5 ml离心管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中,再将50 ml管放在封口袋中。使用足量的干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。
E. 其他特殊样品:
ChIP项目至少要求50ng DNA,以Qubit 2.0检测为准。其余具体咨询嘉美实验高通量测序部。

5、其他注意事项
请务必标记清楚并随样品附上样品信息单;样品请自行保留备份,以便在出现外源污染的情况时能迅速查清原因;项目完成数据提交后,我方不保存样品,项目结束一个月后将予以清理。
 
 
四、嘉美实验测序具体开展项目
1、转录组测序
2、外显子测序
3、CHIP-SEQ
4、小RNA测序
5、宏基因组测序
6、小基因组测序
7、全基因组重测序
8、植物降解组测序
9、甲基化焦磷酸测序
……


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