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SiRNA/ShRNA基因干扰实验

 
一、RNA干扰(基因沉默)介绍
RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰,可以特异地将特定的基因沉默,从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。我公司可提供siRNA/shRNA/miRNA等多种序列的设计,并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi相关的病毒包装、RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。
 
RNAi干扰实验技术服务
 
二、RNA干扰原理
在RNAi研究中,测定敲除效率时,通过转染控制的最适化,可以获得高敲除效果。因此,为了将RNAi研究成功导入,需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。
 
三、嘉美实验服务流程
1、对需要用于转染的细胞进行细胞培养;
2、优化转染条件:在荧光显微镜下检测Fluorescent Oligo或可表达GFP的干扰载体的荧光强度,评估转染效率;
3、为靶基因设计一组siRNA双链或干扰载体;
4、采用荧光定量RT- PCR或免疫蛋白印迹评估转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化;
5、可利用抗生素来筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株。
 
四、嘉美实验的客户需提供:
1、选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤;
2、选择的靶基因cDNA的序列号;
3、抗体(如果需要Western blot检测)。
 
五、嘉美实验结果
1、转染效率分析
2、Knockdown分析,包括荧光定量PCR检测报告、Western Blot图片等

六、嘉美实验RNA干扰服务内容
1、 RNAi载体构建
RNAi载体表达可以长时间稳定地研究基因功能,载体在细胞中持续抑制靶基因的表达可达数周。利用抗性基因可用对应抗生素筛选出抑制靶基因表达的稳定细胞株。 

A、pRI-CMV/GFP-miRNA载体构建——第二代RNA干扰载体。利用细胞内源性miRNA加工机制,比传统shRNA更高效地表达小干扰RNA前体,具有表达GFP标签可以方便地进行表达追踪和可以同时表达多个miRNA的优点。在转染效率大于80%的前提下,嘉美实验对单个基因设计3条RNA干扰序列,可以保证至少1条可以达到干扰效率70%以上。 
  *第二代RNA干扰载体平台,更高干扰效率和RNA干扰片段设计成功率。 
  *采用pRI-CMV/GFP-miRNA载体(Cat. No V6501)。载体中带有GFP荧光标签和Neomycin抗性基因。 
  *利用细胞内源性miRNA加工机制技工出与靶基因100%同源的miRNA,对靶基因进行切割,保证大于70%基因敲减成功率。 
  *GFP标签与miRNA由同一启动子驱动协同表达,方便地追踪miRNA表达的实际情况。 
  *可将多个miRNA序列串联到一起,实现对多个基因的同时干扰。 
  *CMV启动子可以替换为其他组织特异性启动子,与病毒感染体系配合,实现组织特异性基因敲减。 
  *与j嘉美实验病毒表达系统兼容。

实验原理 :
  pRI-CMV/GFP-miRNA载体采用CMV启动子高效表达人工设计的miRNA,后者从肠道转录本被加工,进而导致特异性的miRNA降解。 
服务流程 :
  1)针对特定基因,设计miRNA序列,合成寡核苷酸并退火成双链DNA。 
  2)将DNA与pRI-CMV/GFP-miRNA载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞。 
  3)测序验证插入miRNA片段序列无误。 
  4)制备质粒和菌株。 
  5)提交电子版测序结果报告和载体信息给客户。 
客户提供 :
  靶基因的GeneBank号。 
嘉美实验提供 :
  构建好的pRI-CMV/GFP-miRNA载体质粒和相应菌株。 
 
B、pRI-H1 shRNA干扰载体——H1启动子启动的shRNA干扰载体系列。包括带或者不带GFP荧光标签、Neomycin或Hygromycin抗性基因以及可诱导的TetOn载体可供选择。 
  *采用pRI系列载体H1启动子和H1 Teton启动子。 
  *有带和不带荧光标签以及多种筛选抗性基因可供选择。 
  *用于直接细胞转染实验。 
  *与嘉美实验病毒表达系统兼容。
 
 
 
实验原理:
  shRNA克隆到pRI H1载体转录为发卡结构RNA,经过Dicer剪切后形成成熟siRNA,进而导致靶基因mRNA干扰。 
服务流程:
  1)设计shRNA序列,合成该序列 并退火生成双链DNA。 
  2)将DNA与pRI系列载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞。 
  3)制备质粒和菌株。 
  4)提交电子版测序结果报告和载体信息给客户。 
客户提供: 
  靶基因的GeneBank号。 
嘉美实验提供 :
  构建好的pRI H1启动子载体质粒和相应菌株。 
 
2、RNAi转染优化
  包括siRNA导入优化和质粒转染优化。由于siRNA和RNA干扰载体都需要转入细胞才能发挥作用。因此如何高效地将RNA干扰产品转入细胞是成功进行RNA干扰实验的关键步骤。嘉美实验有专业的siRNA和质粒转染技术,可以对转染效率进行优化,提升RNA干扰效果。 
  *293细胞干扰RNA干扰效率验证服务 
  *客户细胞系转染条件优化,干扰效率验证服务 
  *siRNA干扰效率优化 
 
服务内容:
  1)293细胞干扰效率验证服务——构建好的RNA干扰质粒转染293细胞,通过荧光定量RT-PCR或者Western-blot验证干扰效率。 
  2)客户细胞株转染优化和干扰效率验证服务——转染效率是RNA干扰成功的关键步骤。嘉美实验采用Genefection系列转染试剂,通过对转染效率优化提升RNA干扰效率。在客户细胞中验证RNA干扰效率。 
  3)siRNA干扰效率验证服务——采用siRNA转染试剂进行预转染实验,优化转染效率,通过荧光定量RT-PCR或者Western-blot验证干扰效率。 
服务流程:
  1)培养细胞 
  2)优化转染条件:在荧光显微镜下观察转染效率或者用流式细胞检测评估转染效率。 
  3)根据靶基因序列设计一组RNA干扰序列。 
  4)采用荧光定量PCR或Western blot评估RNA干扰效率。 
  5)(可选)用相应抗生素筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株。 
客户提供:
  1)细胞系资料和详细的细胞培养步骤。 
  2)靶基因GeneBank编号。 
  3)抗体(如果需要Western blot检测)。 
嘉美实验提供 :
  1)转染效率分析优化 
  2)RNA干扰效率分析 
质量保证:
  1)针对一个靶基因设计的3条siRNA可保证其中1条干扰效率大于70%(在转染效率大于80%的前提下)。 
  2)针对一个靶基因设计构建的3个miRNA干扰载体可保证其中1个干扰效率大于70%(在转染效率大于80%的前提下)。
 
3、RNA干扰慢病毒、腺病毒包装服务
  针对特别难转染的细胞及活体动物实验,采用慢病毒或腺病毒载体进行RNAi研究。 
  *技术平台:第三代4质粒慢病毒表达系统;pRI-CMV/GFP-miRNA载体;pRI系列H1启动子载体。 
  *包装为慢病毒颗粒,对分裂和非分离细胞均有感染作用。 
  *适合用于难转染的细胞和动物RNAi研究。 
  *稳定整合到细胞基因组,适合制备稳定基因敲减细胞株。 
  *去除了病毒的关键蛋白,对人体安全;属于复制缺陷型病毒,不会产生下一代病毒颗粒;已被改造为自身失活性,病毒转导并整合到细胞后不再具有产生具有包装能力的病毒基因组。 

服务原理 :
  慢病毒属于逆转录病毒的一种,与其它逆转录病毒相比,慢病毒具有可以感染非分裂期细胞、可以长期表达等显著优点。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体依靠转染传统转染试剂难于转染的细胞系和原代细胞,并且可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。 
服务流程 :
  1)慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取。 
  2)转染293T细胞。 
  3)培养收集含有病毒上清的培养液。 
  4)病毒的纯化和浓缩。 
  5)滴度测定。 
  6)(可选)将病毒液转导客户的靶细胞,筛选稳定细胞株,检测靶基因表达。 
客户提供:
  1)miRNA或shRNA表达质粒 
  2)所需病毒滴度和总量 
嘉美实验提供:
  1)构建好的慢病毒载体质粒 
  2)已测定滴度的慢病毒
 
4、RNAi效果检测
  用实时定量PCR或者Western blot方法在RNA水平或蛋白水平检测基因敲减效果。 
  *采用复制缺陷的第二代腺病毒表达系统,安全性更高;重组腺病毒再培养基中非常稳定。 
  *干扰几乎所有的细胞类型,不整合到染色体中。 
  *能有效增殖,滴度高。腺病毒系统可产生10^8至10^9TU/ml腺病毒,浓缩后可达10^10至10^11。 

服务原理 :
  腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的双链DNA病毒,它能感染分裂和非分裂细胞。目前采用的第二代腺病毒表达系统属于E1、E3基因缺陷型腺病毒,仅能在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制。腺病毒载体能在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;不整合到染色体中。对于难转染的细胞如原代细胞核非分裂细胞,采用腺病毒进行miRNA和shRNA递送是非常有效的方式。 
服务流程:
  1)构建表达miRNA/shRNA的腺病毒载体。 
  2)转染293A细胞。收获细胞以制备病毒粗提液。 
  3)将病毒粗提液感染293A细胞扩增病毒。 
  4)确定病毒滴度。 
  5)浓缩纯化病毒。 
客户提供:
  1)表达miRNA/shRNA的质粒。 
  2)所需的病毒量和滴度。 
嘉美实验提供:
  1)构建好的腺病毒载体质粒 
  2)已测定滴度的腺病毒储存液
 
5、RNAi稳定细胞株筛选
  利用抗性基因筛选RNA干扰稳定细胞株。 
 
6、siRNA合成
  对于瞬时基因沉默实验,化学合成的siRNA具有操作方法简便,容易获得高水平的瞬时沉默效果,特异性强的优点。适合进行初步RNA干扰序列的筛选及瞬时基因敲减实验。嘉美实验设计的每条siRNA序列都经过同源性筛查,保证siRNA干扰效果的特异性。针对靶基因设计的3条siRNA序列保证其中1条的干扰效果大于70%(在转染效率大于80%)的前提下。 
  1)普通siRNA合成——HPLC纯化,100%去除单链RNA。 
  2)化学修饰siRNA——2’-Fluoro或2’-OMe提高siRNA在血清和培养基中的稳定性,作用时间长于普通siRNA。 
  3)荧光标记siRNA——标记后的siRNA可用于流式细胞仪、荧光显微镜和激光共聚焦检测,可以方便监测转染效率,优化转染条件。
  *可进行科学周到的序列设计服务,产品经过严格测试,确保质量稳定。 
  *所有siRNA oligo均有HPLC纯化,100%去除未配对的单链。 
  *有普通siRNA,化学修饰siRNA、荧光标记siRNA可供选择。 
  *化学合成的siRNA具有操作简便,转染效率高,对细胞或组织毒副作用小,制备方便等特点,适用于对RNA干扰有效序列的筛选。 

服务原理 :
  siRNA双链结合到核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC通过同源配对定位到靶基因mRNA上,导致靶基因mRNA降解。 
服务流程: 
  1)设计RNA干扰序列,进行化学合成 
  2)HPLC纯化 
  3)冻干处理 
客户提供:
  1)siRNA oligo的序列信息或靶基因Genebank编号(如果需要我们进行RNA干扰序列设计)。 
  2)需要的OD数,修饰要求。 
嘉美实验提供 :
  siRNA双链冻干粉。类型包括: 
  1、普通siRNA——HPLC纯化,100%去除未配对的单链。 
  2、化学修饰siRNA——利用2’-Fuoro或2’-OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性,作用时间长于普通siRNA。 
  3、荧光标记siRNA——FAM标记siRNA,可以方便地对转染效率进行观察。 
质量保证:
  针对靶基因设计的3条siRNA可保证其中至少1条的基因敲减效率在70%以上(在转染效率大于80%的前提下)。
 
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