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   MSP/BSP甲基化检测

一、MSP 甲基化检测实验服务

MSP甲基化检测结果

实验技术简介:甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式,它不改变DNA的一级结构,却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象,而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此,基因启动子甲基化检测在临床诊断(如p16甲基化检测与低剂量CT等相结合)、药物敏感性实验等(如靶向药物)等方面具有很高的应用价值。 目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法。

 

实验技术原理:
MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描观察分析结果。

 

实验操作流程:
1、提取基因组DNA,并定量(组织、细胞、全血、血浆、血清等);
2、亚硫酸氢钠处理DNA(PH5.0 500C  8-16hr 所有试剂新鲜配置);
3、DNA修饰后纯化回收;
4、PCR检测(引物、退火温度);
5、琼脂糖凝胶电泳\拷贝数。

 

实验注意事项:
客户提供:

1、组织样品:新鲜组织放入液氮或-80度保存,组织不少于100mg;
2、培养细胞:通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80℃,避免反复冻融);
3、血液细胞标本:以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-80℃可长期保存,避免反复冻融);
4、血清或细胞培养液标本:离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(4℃可保存15-20天,-80℃可长期保存,避免反复冻融);
5、样本运输:可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后,加冰袋寄送;
细胞样本也可直接寄送培养瓶(密封保证不污染、培养液不漏出);
血清或上清液直接加冰袋寄送(送视路程远近2-3天可到达)。

交付标准:
1、图片
2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)

其他:
1、实验流程长,操作烦琐,不易控制;
2、实验操作要求熟练而精细:若起始DNA量太多,则修饰不完全;若量太少,则在修饰、回收过程中易丢失。
3、修饰过程,需保证pH值准确,所有试剂要求新鲜配置,需要摸索最适反应时间。
4、需对PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择配置进行优化。

 

二、BSP 甲基化检测实验服务


实验技术简介:DNA甲基化在人的正常发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病(如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)过程中发挥重要作用,已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。该方法为甲基化检测的金标准,可定量检测基因甲基化水平。基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,最后对PCR产物进行克隆并选取8-10个转化子序列,即可确定所研究的CpG区域的甲基化频率。

 

实验技术原理:
用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。

 

实验操作流程:
1、基因组DNA的提取和定量;
2、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA;
3、修饰后DNA纯化回收;
4、根据目的基因启动子序列设计相应引物;
5、PCR扩增
6、PCR产物克隆并测序;
7、数据分析;

 

 

实验注意事项:
客户提供:

1、组织样品:新鲜组织放入液氮或-80度保存,组织不少于100mg;
2、培养细胞:通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80℃,避免反复冻融);
3、血液细胞标本:以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-80℃可长期保存,避免反复冻融);
4、血清或细胞培养液标本:离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(4℃可保存15-20天,-80℃可长期保存,避免反复冻融);
5、样本运输:可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后,加冰袋寄送;
细胞样本也可直接寄送培养瓶(密封保证不污染、培养液不漏出);
血清或上清液直接加冰袋寄送(送视路程远近2-3天可到达)。

交付标准:
1、图片
2、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)

其他:
1、引物设计不能含有CpG位点,以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。
2、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点,BSP扩增片段长度300-500bp,包含的CpG位点越多则引物的打分越高。

具体实验咨询,请联系嘉美实验


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