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细胞周期检测

一、嘉美实验细胞周期检测介绍
细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中,细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

二、细胞周期的流式检测方法
细胞周期的流式检测方法  细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为G0/G1期、S期、G2/M期。在科研实践中,很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。细胞群体周期测定的方法有很多种,最常用的是PI(碘化丙啶)渗入DNA进行染色,然后通过流式细胞仪检测PI从而测定细胞群体的周期分布。  因此,主要通过BD(Becton&Dickinson)公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪测定PI标记的细胞群体为例,对细胞周期的流式检测方法进行阐述。 
1、PI染色步骤
  1)单细胞悬液离心,1500rpm , 5min,弃上清。 
  2)PBS 1ml离心,弃上清。 
  3)70%酒精2ml,4℃,30min,离心,弃上清液。 
  4)PBS 1ml离心,弃上清。 
  5)RNase A的PBS溶液 (20ug/ml),500ul,37℃,30min,离心弃上清。 
  6)PBS 1ml离心,弃上清。  
  7)PI的PBS溶液(50ug/ml),500ul,室温避光孵育30min。 
  8)吹打混匀,300目筛网过滤至流式管中,4℃保存,待测。 

2、Calibur仪器设置及数据收集
  1)依次打开Calibur机器电源、电脑开关和CellQuest Pro软件,按快捷键Command+B连机,按快捷键Command+1、2、3、4调出Detectors/Amps面板、Threshold面板、Compensation面板和Status面板,软件的操作界面如下图所示。
 

Cell Quest Pro软件操作界面
 
  2)建立实验模板,包括FSC/SSC散点图、FL2-W/FL2-A散点图和FL2-A直方图。因为PI在Calibur上是由488nm的激光器激发,530/30滤光片收集信号,所以选择FL2通道进行检测。细胞周期是2N和4N的循环,所以FL2通道的Mode参数应设置为Lin模式,同时阈值(Threshold)的Primary Param参数设置为FL2-H,Four Color DDM Param参数设置为FL2,如下图所示。
 
      Detectors/Amps面板                        Threshold面板 

  3)设置细胞的收集数目,数据保存的路径和名称。如图下面两图所示。
 

Acquisition&Storage面板 

Acquisition面板 

  4)选Setup选项,点击Acq勾uire按钮进行数据收集并调节FL2通道的电压值使得周期图位于FL2直方图中合适的位置。在下图所示的操作面板中,调好电压后,将Setup选项勾掉,点击Acquire按钮收集数据。数据以.FCS格式保存在之前预设好的文件夹中。


Acquisition Control面板 

3、细胞周期数据的分析
流式数据分析软件有很多种,比如Cell Quest、BD FCAS Diva、FlowJo等等。但对于细胞周期数据的分析,统一的分析步骤如下: 
  1)建立FSC/SSC散点图,圈定细胞群,如下图所示。
 
FSC/SSC散点图
  2)建立FL2-W/FL2-A散点图,去除粘连细胞,如下图所示。


FL2-W/FL2-A散点图 
  3)建立FL2-A直方图分析细胞周期,如下图所示。


FL2-A直方图
 
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