Hi,欢迎来到嘉美实验中心
公司文化|联系我们

lab-manager@jiamay.com400-000-7401

(扫一扫关注我们)

联系我们

电 话:400-000-7401

邮 箱:lab-manager@jiamay.com

地 址:北京市昌平区中东路5号院4号楼1809

邮 编:100012

细胞增殖/毒性MTT/CCK8实验

一、各种细胞增殖与毒性检测方法简介
1、MTT检测实验服务:原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用,以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响(如细胞活力、增殖、凋亡等方面)。
 
2、SRB检测实验服务:磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料,其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。SRB法应用非常广泛,如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

3、CCK-8检测实验服务:Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒,是一种基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品,工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。
 
4、WST-1检测实验服务:WST-1产生的formazan是水溶性的。WST-1非常稳定,使实验结果更加稳定。WST-1线性范围宽,灵敏度高。可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测,也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测,或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。WST-1使用时无须同位素,所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞,不必收集细胞,也不必采用额外步骤去溶解formazan。 WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,便于找到最佳测定时间。
 

 
5、XTT-1检测实验服务:XTT作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点:1、使用方便,省去了洗涤细胞;2、检测快速;3、灵敏度高,甚至可以测定较低细胞密度;4、重复性好。缺点:XTT水溶液不稳定,需要低温保存或现配现用。
 
6、MTS检测实验服务:MTS是应用新型的水溶性甲臢化合物快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物,新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物,这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量,而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。
 
 
二、CCK8实验操作步骤
实验一:细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。
2、向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
 
实验二:细胞增殖-毒性检测
1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。
2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4、向每孔加入10μL CCK8溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
 
注意事项:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
 
活力计算:
细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药):具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
细胞活力:即细胞增殖活力或细胞毒性活力
 
 
三、MTT实验操作步骤
1、胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液,细胞计数调整其浓度至5-10×10^4/ml。 对于初学者而言,要使细胞达到5-10×10^4/ml往往不知从何处着手,我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。 以一般细胞培养常用的625px2为例,  
  1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态),消化离心收集后,将上清去掉,加入3ml培养基使其混匀。
  2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用),装入约9ml培养基。
  3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管,混匀后细胞计数,此时一般为或小于5-10×10^4/ml,该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度,再根据计数的结果滴加细胞悬液,每滴按50ul计算。
  4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整,如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×10^4/ml),细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×10^4/ml)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。

2、将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。  
注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加6个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于MTT的结果至关重要。  

3、将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个,否则难以反应真shi情况。下图可做为96孔板的的参考步局。对于加药,有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中,以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好,然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基,这样能保证药物浓度的准确。另外,需注意的是,如果用这种方法,不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药,应该吸完一部分后立即加样,避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。  
 
4、5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。  
 
5、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。  
 
6、终止培养,准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种。  
  1)第一种,用DMSO溶解
   (1)MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。将上清去掉,该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走,也有人建议先铺几张滤纸在桌面,然后将96孔板轻轻倒置,这样上清便被滤纸吸走,以减少结果的损失。个人认为,这两种方法都有可能导致结晶的损失,从而引起结果的不准确。采用哪种方法,可以自己摸索一下再决定。
   (2)每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。  
 
  2)另一种方法,用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)  
   (1)MTT加入培养4h后,结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS,在低温保存的时候易产生结晶,因此在用之前必须提前几小时拿至室温,将SDS结晶全部溶解后再使用。)  
   (2)放入培养箱中继续孵育4—6小时,镜下观察,待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右,紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少,溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多,溶解的时间会长一些。  在实际的操作过程中,往往为了等待4-6小时,使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值,给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索,加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响,但要注意的是一定要避光,不过培养箱关闭后本身就是闭光的,所以加入溶解液后放入培养箱中,第二天上班时再测OD值就可以了。  
 
7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
 
MTT结果分析:关于如何计算IC50    
改良寇式法: lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) 
Xm: lg 最大剂量 
I: lg(最大剂量/相临剂量) 
P: 阳性反应率之和 
Pm: 最大阳性反应率 
Pn: 最小阳性反应率
 
四、实验服务注意事项及标本的储存与运输
1、实验委托者提供实验分组情况及实验背景资料,有具体要求请事先说明;
2、实验委托者提供检测细胞或实验室负责提供,请咨询公司以明确是否有检测细胞株;
3、干预药物由实验委托者提供,如无则由双方协商公司代购;
4、标本收集与保存:一般情况下由公司实验室负责准备检测样本,实验委托者提供细胞或实验室提供细胞;
5、细胞样本运输:如实验委托者提供细胞进行试验,细胞样本以干冰运输或者直接寄送培养瓶(密封保证不污染、培养液不漏出);
 

五、嘉美实验细胞毒性与增殖服务内容
1、检测细胞活性:细胞毒性实验;
2、药物的筛选:包括药物剂量及给药时机的筛选,评价药物的安全性等;
3、一些蛋白分子、细胞因子的活性检测。
 
更多具体实验咨询,请联系嘉美实验
 

© 2017 北京嘉美臻元生物技术有限公司 保留所有权利 京ICP备10216606号-3