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细胞稳定株制备

 
一、嘉美实验细胞稳定株制备介绍
1、细胞稳定株制备基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418来代替新霉素进行选择性筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

2、稳定细胞株的构建周期长、难度大,每一步都很关键,尤其是细胞转染,常用物理方法(电转)、化学方法(脂质体等)、生物方法(病毒),根据不同的实验条件,选择好的方法,来达到实验目的。

3、嘉美实验在稳定细胞株构建上拥有丰富的经验,熟悉每一步操作,尤其对关键步骤有独到的经验,成功为众多科研客户构建目的细胞株(过表达、可诱导过表达、沉默、可诱导沉默、报告基因等等)。
 
二、嘉美实验细胞稳定株制备过程
1、基因过表达:目的基因的过表达往往是研究该基因/蛋白功能的常规手段,也是借助表达系统富集蛋白(DHFR、GS system)的方法。基因过表达稳定细胞株的构建能很好的帮助研究这个蛋白,或者得到大量的目的蛋白。主要包含如下步骤:
  1)载体构建(表达质粒载体、病毒载体);
  2)转染/感染;
  3)目的蛋白初步检测;
  4)抗生素筛选;
  5)目的蛋白再次检测(定性/半定量);
  6)单克隆细胞株稳定性检测。
  备注:特殊的过表达基因蛋白/细胞,请事先咨询。
 
2、基因沉默:基因沉默(knock-down or knock-out)往往是研究该基因/蛋白功能的常规手段,蛋白沉默后细胞表型的检测是科研的金标准方法。主要包含如下步骤:
  1)载体构建(沉默质粒载体、病毒载体);
  2)转染/感染;
  3)目的蛋白初步检测;
  4)抗生素筛选;
  5)目的蛋白再次检测(定性/半定量);
  6)单克隆细胞株稳定性检测。
  备注:特殊的过表达基因蛋白/细胞,请事先咨询。

3、诱导:外源蛋白的诱导表达/沉默能很好比较本底和干预的区别,非常有力的诠释目的基因/蛋白的作用机理,特别适合研究自身具有毒性的蛋白,现已经被广泛使用。主要包含如下步骤:
  1)载体构建(诱导质粒载体、病毒载体);
  2)转染/感染;
  3)“开关”诱导下目的蛋白初步检测;
  4)抗生素筛选;
  5)“开关”目的蛋白再次检测(定性/半定量);
  6)单克隆细胞株稳定性检测。
  备注:特殊的过表达基因蛋白/细胞,请事先咨询。

三、嘉美实验细胞稳定株制备服务流程
1、客户提供
  1)生长良好的细胞;或者由嘉美实验代购细胞;嘉美实验室有的细胞,由嘉美实验室免费提供。
  2)提供详细实验方案;或者由嘉美实验代为设计实验方案,客户予以配合及确认。
 
2、服务说明
  1)稳定细胞株构建依据目的不一样,方案差异非常大,成功率差异也很大,本着对客户负责的态度,建议事先咨询,并且安排预实验;
  2)客实验委托者可以提供基因序列、载体、细胞,也可以查找本公司模板库、载体库、细胞库,也可以由我们公司代购;
  3)本服务仅对目的基因的表达、稳定性做,不涉及基因功能,具体基因功能检测,需要另外评估和收费。
 
3、交付内容
  1)构建好的质粒(4ug)/病毒(1ml),含目的基因序列/沉默序列/诱导序列;
  2)稳定细胞株2管;
  3)实验报告:详细操作步骤、结果分析。


 更多的实验具体咨询,请联系嘉美实验
 
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