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细胞趋化实验


一、嘉美实验细胞趋化实验介绍
1、趋化性(Chemotaxis,亦被称为化学趋向性)是趋向性的一种,指身体细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。这对细菌寻找食物(如葡萄糖)十分重要,细菌以此趋进有较高食物分子浓度的地方,或远离有毒(如苯酚)的地方。在多细胞生物中,趋化性对其发展和其他正常功能一样不可或缺。正趋化性指趋向较高化学物质浓度的运动,而负趋化性则相反。

2、趋化实验是根据靶细胞(单核巨噬细胞,中性粒细胞或淋巴细胞等)能够趋化性主动迁移,穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜(聚碳酸脂膜)将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面,趋化因子在下面,趋化因子通过滤膜形成梯度,细胞则沿着梯度穿过膜孔,黏附在膜的下面,计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。



 
二、趋化实验操作步骤
1、在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释,将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室,30ml/孔,每个浓度加3 个孔,其中只加BM的孔为阴性对照;
 
2、取对数生长期细胞,0.1%BM 重悬细胞,调整细胞浓度为5×10^5/ml;
 
3、加样:下室加不同浓度的趋化因子,将膜轻轻对折后展平,光面朝下毛面朝上,依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞,50ml/孔,每个浓度加3 个孔;
 
4、将趋化小室在 37℃,5% CO2 的孵化箱中孵育3h;
 
5、在膜的两端加上夹子,毛面在PBS 液面上蘸取,光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦,再蘸取PBS,反复3 次后再蘸取一次,晾干;
 
6、固定, 染色;
 
7、取载玻片,剪角放在右上角,滴一滴石蜡,盖玻片封片;
 
8、显微镜观察计数,每孔至少 3 个随机视野,3 个孔的数值取平均值;作柱状图,纵轴趋化指数或细胞数,横轴组别;
 
9、趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目。

三、实验操作注意事项
1、膜,胶垫,上下小室之间防止有气泡产生。
 
2、放膜时要对准位置,过多调整位置,易发生交叉污染。
 
3、枪垂直,枪尖伸入孔中下大概4/5 处,迅速加样,不要迟疑,打出液体的过程枪逐渐抬起,液体全部打出时枪尖离开液面。
 
4、洗膜时注意,不要把细胞面与非细胞面弄反。
 
四、嘉美实验细胞趋化实验服务流程
1、客户提供
  1)生长良好的细胞;或者由嘉美实验代购细胞;嘉美实验室有的细胞,由嘉美实验室免费提供。
  2)提供详细实验方案;或者由嘉美实验代为设计实验方案,客户予以配合及确认。
 
2、交付内容
  实验报告:详细操作步骤、结果分析

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