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细胞内钙离子检测

一、嘉美实验细胞内钙离子检测介绍
1、钙离子在细胞的生理活动中起着重要的作用,游离钙离子浓度的变化与细胞的功能、信号的传递及其损伤和凋亡都有着密切的联系。钙离子是单个细胞生存和死亡的信号,并调控它的种种功能。钙流检测是药物研发中G蛋白偶联受体(GPCR)筛选的首.选方法,同时,胞内钙离子浓度的变化也是细胞凋亡研究的手段之一。因此,钙离子荧光染料被广泛使用,它们具有细胞透性,因此可以染活细胞。它们与钙离子结合后荧光强度大大提高,可用于流式细胞术、免疫荧光和荧光色谱分析。
 
2、钙离子在细胞的生理活动中起着重要的作用,游离钙离子浓度的变化与细胞的功能、信号的传递及其损伤和凋亡都有着密切的联系。钙离子是单个细胞生存和死亡的信号,并调控它的种种功能。钙流检测是药物研发中G蛋白偶联受体(GPCR)筛选的首.选方法,同时,胞内钙离子浓度的变化也是细胞凋亡研究的手段之一。因此,钙离子荧光染料被广泛使用,它们具有细胞透性,因此可以染活细胞。它们与钙离子结合后荧光强度大大提高,可用于流式细胞术、免疫荧光和荧光色谱分析。Fluo-4 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。

3、Fluo-4 AM在Fluo-3 AM的基础上改进而成,其特点是加载更快并且在相同条件下荧光更加明亮。Fluo-4 AM将Fluo-3 AM结构中的氯原子替换成了氟原子,导致它的最大激发波长会向短波长处偏离12nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长488nm,所以用氩激光器激发时,Fluo-4的荧光强度会比Fluo-3强一倍。由于Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3相近,所以使用上和Fluo-3也基本相同,可以使用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪等荧光检测仪器来测定细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4 AM和Fluo-3 AM的结构式如下图。
 
Fluo-4 AM和Fluo-3 AM的结构式。
 
4、Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物,是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-4 AM的荧光非常弱,其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-4 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4,从而被滞留在细胞内。Fluo-4可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激发波长为494nm,最大发射波长为516nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右,发射波长为512-520nm。Fluo-4的激发光谱和发射光谱如下图。
 
Fluo-4的激发光谱和发射光谱
 
5、用于细胞内钙离子检测时,Fluo-4 AM的常用浓度为0.5-5μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育10-60分钟进行荧光探针装载,随后适当洗涤,洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成Fluo-4。

二、嘉美实验细胞内钙离子检测操作步骤
操作步骤
1、取适量Fluo-4 AM母液,用PBS稀释至0.5-5μM的工作液。工作液须即用即配,请勿反复冻融。
2、对于待检测的培养细胞,去除培养液,用PBS或HBSS洗三遍。因为培养液中的血清含有酯酶会导致Fluo-4 AM分解为Fluo-4,而酚红会导致荧光背景增强。
3、加入Fluo-4 AM工作液,溶液量以能充分覆盖细胞为准。
4、20℃-37℃孵育10-60分钟进行荧光探针装载。如果是首次实验不能确定孵育温度和时间,建议先尝试37℃孵育30分钟,观察荧光效果。如果细胞死亡较多,则适当缩短时间或降低温度;如果荧光强度太弱,则适当延长时间。
5、随后用PBS或HBSS洗涤3次,洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内完全转变成Fluo-4。
6、如有需要,可以使用适当药物来刺激细胞。
7、用激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、荧光分光光度计或流式细胞仪等荧光检测仪器检测Fluo-4的荧光,以确定细胞内钙离子浓度的变化。

注意事项
1、Fluo-4 AM遇水极易分解,建议第一次使用时,母液分装并密封保存,同时注意保持干燥。
2、Fluo-4 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3、探针的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等需要根据不同实验预先摸索。
4、荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
 

三、嘉美实验细胞趋化实验服务流程
1、客户提供
  1)生长良好的细胞;或者由嘉美实验代购细胞;嘉美实验室有的细胞,由嘉美实验室免费提供。
  2)提供详细实验方案;或者由嘉美实验代为设计实验方案,客户予以配合及确认。
 
2、交付内容
  实验报告:详细操作步骤、结果分析 

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