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细胞克隆(集落)形成实验


一、细胞克隆(集落)形成实验介绍
1、细胞集落形成实验是检测培养细胞增殖能力的有效方法之一。由于它是通过检验活细胞的增殖能力,因此避免了在生长曲线绘制时将死细胞或不能再分裂细胞计数在内而导致的实验结果误差。
    
2、细胞集落形成实验的原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上,其后代形成一个细胞群体,称为集落(colony)。每个克隆均包含50个细胞以上,大小在0.3~1.0 mm之间。通过计算集落形成率(colony forming efficiency),来测定测试细胞的增殖能力。
 
二、细胞克隆(集落)形成实验基本步骤
1、将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化,完全培养基重悬,制成细胞悬液,计数。
 

吸弃培养基


PBS清洗


加入胰酶


终止消化


收集细胞


离心获取沉淀


细胞计数
 

2、在6孔板培养板中各实验组接种500-1000个细胞/孔[正常增殖速度为1:5-1:10传代,3天长满细胞,可以接种500个细胞,其余增殖缓慢细胞,可以接种800-1000;接种时注意梯度稀释细胞悬液,观察细胞密度,以免因计数不准确导致实验结果偏差,每个实验组设3个复孔,培养基为含30%FBS的完全培养基。
 

铺板


摇匀
 
3、将接种好的细胞摇匀后轻放于培养箱中继续培养,每隔3 天进行换液并观察细胞状态,显微镜下观察克隆大小(3复孔之间克隆大小应相似),待单个克隆生长到大小不超过图片视野时可以进行拍照。

4、拍完照之后的将6孔板放入培养箱中继续培养,待孔中大多数单个克隆中细胞数大于50为止,弃上清,PBS洗涤细胞1次。

5、每孔加入1 mL 4%多聚甲醛,4度冰箱固定细胞60 min,PBS洗涤细胞1次。
 

加多聚甲醛
6、每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000 μL,染细胞2min。

 

6、ddH2O洗涤细胞数次,晾干,数码相机拍照整,克隆计数。
 

吸弃染液


加入超纯水清洗


晾干
 
 

拍摄
 
三、细胞克隆(集落)形成实验注意事项
1、接种时细胞密度适度,不可过高。
2、软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃,否则将会烫伤/死细胞;
3、琼脂对热和酸不稳定,若反复加热,容易降解而产生毒性,且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装;
4、细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响;
5、细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降,永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%,甚至无法形成单个克隆。因此,为了提高克隆形成率,有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。
6、细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。
 

 
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