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细胞划痕(修复)实验

一、细胞划痕实验介绍
1、细胞划痕(修复)法是一种简单易行的测定细胞迁移运动与修复能力的方法,实验成本低。类似体外伤口愈合模型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间(例如72h),取出细胞培养板,观察周边细胞是否生长迁移(修复)至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力。实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,以观察不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力。与transwell相比,细胞划痕实验具有经济、操作方便等优势。

2、实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力,可以判断各组细胞的迁移与修复能力。
二、细胞划痕实验操作步骤
实验材料
1、细胞培养平板,一般使用6 孔板,大小合适,便于划线和观察;
2、marker笔,用于观察是标记;
3、直尺,用于观察时对细胞划痕宽度测量;
4、20微升枪头(灭菌)或者经过灭菌处理的牙签均可,用于在单层细胞上划痕;
5、无血清培养基;
6、PBS  

实验步骤
1、培养板划线
  首先使用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。划线时注意线不要太粗。
2、铺细胞  在孔中加入约5×105个细胞(不同的细胞数量有所不同,根据细胞的生长快慢调整),接种原则为过夜后融合率达到100%。
3、细胞划线  第二天用枪头或者无菌牙签,垂直与细胞平面,沿着投一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。
4、洗细胞  划痕完成后,使用无菌PBS洗细胞3次,洗去不贴壁的细胞,即划线时划线的细胞,是划线后留下的间隙清晰可见,然后更换新鲜无血清培养基。
5、细胞培养、观察  将细胞放入37℃ 5% CO2培养箱,培养。然后在适当的时间点,如0,6,12,24h取出细胞,显微镜线观察并测量划痕的宽度,并拍照(具体时间依实验需要而定)。
6、结果分析  使用Image J软件打开图片后,随机划取6至8条水平线,计算细胞间距离的均值。  
 

 
操作注意事项
1、铺细胞最好使用6孔板,因为6空板可以保证有相当距离的平直划痕,而且因为有5条定位线,与划痕相交,这样就有10个可固定监测点,不作重复,误差也很小。 
2、如果你连续监测24小时,你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果,而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移,你可以先用丝裂霉素(1 μg/ml)处理一小时,抑制细胞的分裂,这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外,使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。 
3、照片拍完之后,可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。 
4、虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响,但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节,细胞迁移的速度也会慢很多。

划痕法测量迁移的不足之处:适用的细胞范围小,一般只能适用于上皮细胞、纤维样细胞  划痕法的不足也很明显,适用的细胞系很窄,一般只能用于上皮,纤维样细胞系。因为:
1、这些细胞本身有迁移能力,且较强;
2、细胞有极性,方便测量,观察;
3、细胞对无血清有较强的忍受力(至少24小时),因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的。 

三、嘉美实验细胞划痕实验服务流程
1、细胞培养与划痕处理;

2、无血清、低血清培养;

3、细胞观察与拍照;

4、计算迁移率与撰写实验报告。
 
5、客户提供:
 
  1)提供状态良好的细胞和药物等生物材料;或者由嘉美实验代买。嘉美实验室如有成熟细胞,按照相关规定提供。
  2)详细的细胞划痕实验设计,如药物处理浓度、作用时间等;或者由嘉美实验代为设计细胞划痕实验,客户予以确认。
 
6、嘉美实验提供:原始数据及统计分析结果、完整实验报告。
 
    
 
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