Hi,欢迎来到嘉美实验中心
公司文化|联系我们

lab-manager@jiamay.com400-000-7401

(扫一扫关注我们)

联系我们

电 话:400-000-7401

邮 箱:lab-manager@jiamay.com

地 址:北京市昌平区中东路5号院4号楼1809

邮 编:100012

细胞凋亡Annexin V/PI法

 
一、细胞凋亡Annexin V/PI流式检测概述
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧,细胞发生凋亡最早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧,这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。Annexin V是一种磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


图1 Annexin V检测凋亡的原理示意图 
 

图2 Annexin V-FITC&PI凋亡的流式示意图

二、细胞凋亡Annexin V/PI流式检测主要试剂 (暂以蛋白FITC标记为例子)                              

成分含量 20 Tests 50 Tests 100Tests
Annexin V-FITC
(蛋白标记物)
100μl 250μl 500μl
10×Binding Buffer 2ml 4ml 6ml
Propidium Iodide 100μl 250μl 500μl
                   
三、细胞凋亡Annexin V/PI流式检测操作步骤
(暂以蛋白FITC标记为例子) 
贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2%的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1×PBS或1×binding buffer洗涤,清除EDTA,以免残余的EDTA与Ca2+螯合,影响Annexin V的结合。
(1)用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer;
(2)细胞收集。悬浮细胞收集:离心5分钟;贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化收集后(注:胰酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合),于室温2000rpm离心5~10分钟,收集细胞;
(3)细胞洗涤:用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次,2000rpm离心5~10分钟,洗涤细胞;
(4)加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞;
(5)Annexin V-FITC标记:加入5μL的Annexin V-FITC混匀后,避光,室温孵育15分钟;
(6)PI标记:上机前5分钟再加入5μL的PI染色。
(7)上机前,补加200μL的1×Binding Buffer。

A、  流式细胞仪分析   
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。 
流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发,Em.= 519 nm检测FITC荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射检测PI。细胞应可分成三个亚群:活细胞仅有很低的荧光强度,凋亡细胞有较强的绿色荧光,坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞)有绿色和红色荧光双重染色。使用流式细胞仪正确分析Annexin V-
FITC/PI 双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT 的电压直接相关,所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI 分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI 分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。 
1、上样未经染色的细胞,在线性FS-SS 点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。 
2、建立LogFL1-LogFL2(最好用FL3)双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞;保证>98%的细胞处于在X、Y 轴Log 1 为边界的左下象限中心区域。 
3、检测Annexin V-
FITC 单染的细胞并检查FL1-FL2(或FL3)散点图,保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏;此时FL1 的荧光被FL2 (或FL3)PMT检测到了。为了纠正这种现象,增加FL1 漏到FL2(或FL3)荧光的补偿%(这可能在1-5%之间)。如果这个调节没有有效地去除FL2 的阳性信号,此时要降低FL2(或FL3) PMT 的电压。 
4、检测PI 单染的细胞并检查FL1-FL2(或FL3)散点图,保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏;此时PI 的荧光被FL1 PMT 检测到了。为了纠正这种现象,增加FL2(或FL3)漏到FL1 荧光的补偿%(这可能在15-25%之间)。如果这个调节没有有效地去除FL1 的阳性信号,此时要降低FL1 PMT 的电压。 
注:如果在以上调节补偿过程中更改了PMT 的电压,建议重复3、4 步骤,确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1 为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。 
5、设定十字门的位置,FL1 和FL2(或FL3)的划定方法如下: 
  1)设定FL1 标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是Annexin V 染色阴性的细胞(一般这些细胞会在FL1 轴方向上升至2 个对数坐标值)。将垂直的FL1 标尺设定在紧靠Annexin V 阴性群体右侧0.1-0.2Log 单位的地方。 
  2)设定FL2 (或FL3)标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞,一是位于散点图的右下方(ANN+/PI-)还有就是右上方(ANN+/PI+)。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞,区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体,将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。 
注:在阴性群体门以外的细胞可被识为Annexin V 或Annexin V 和PI 阳性的细胞。 



  
B、荧光显微镜观察   
1、悬浮细胞染色后,滴一滴细胞悬液于载玻片上,用盖玻片盖上细胞,荧光显微镜下观察。 
2、贴壁细胞可以象悬浮细胞那样染色后, 滴一滴细胞悬液于载玻片上,用盖玻片盖上细胞,荧光显微镜下观察。贴壁细胞也可以先在盖玻片上培养(根据盖玻片大小,置于24孔或12孔细胞培养板内),然后诱导细胞凋亡。染色细胞在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次,加入400μl Binding Buffer于孔中。再加入5μl Annexin V-
FITC与10μl Propidium Iodide,混匀. 避光室温反应10分钟。 
3、将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下观察呈绿色的Annexin V-
FITC荧光信号和PI红色荧光信号。




四、细胞凋亡Annexin V/PI流式检测注意事项
(1)本试剂只适用于实验,不适用于临床检测。
(2)PI(propidium iodide,碘化丙锭)有毒性,能通过皮肤吸收,对眼睛有刺激作用,使用时需戴手套。
(3)Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。在处理和标记时,尽可能在暗处进行。在孵育阶段,用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后,在暗室内用显微镜观察。
(4)整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作,以免影响细胞状态。
(5)在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留,有可能会影响实验结果。
(6)为防止荧光衰变,宜在1小时内进行流式检测。
(7)PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-FITC染色,最短可在上机前5分钟再加入PI染色。
(8)检测所需要的细胞新鲜培养,建议在嘉美实验进行细胞培养,具体的培养方案请与嘉美实验专业人员确认。

更多实验咨询,请联系嘉美实验

© 2017 北京嘉美臻元生物技术有限公司 保留所有权利 京ICP备10216606号-3