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细胞Hochest凋亡染色

 
一、嘉美实验Hoechst染色介绍Hoechst
是德国Hoechst AG公司发明合成的化合物,能溶于水和有机溶剂。Hoechst染料共有三种:Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580。Hoechst是可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,荧光强度随着溶液pH升高而增强,对细胞的毒性较低,主要用于活细胞标记。Hoechst染料可在350nm左右的紫外光激发,在461nm处发出蓝靛色荧光。染色时它直接结合细胞的DNA,无需用DAB显色,经过紫外光激发后发出蓝色荧光。Hoechst染料能少许进入正常细胞膜,使其染上低蓝色,而凋亡细胞的膜通透性增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst比正常细胞的多,荧光强度要比正常细胞中要高,此外,凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合,并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。


二、贴壁细胞Hoechst染色步骤
1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5min或更长时间,无菌超净台内吹干或用无菌的PBS或生理盐水洗涤3次,再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于6孔板或其他培养皿内,接种细胞培养过夜,使融合率约为50%~80%。
2、加入干预条件使细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入Hoechst固定液0.5ml,固定10min或更长时间(可4℃过夜)。
3、去除固定液,用PBS或生理盐水洗2次,每次3min,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动。
4、加入Hoechst33258染色液0.5ml,孵育5min。也宜用摇床,或手动晃动数次。
5、弃染色液,用PBS或生理盐水洗2次,每次3min,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动。
6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片剂,尽量避免气泡。
7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右,发射波长460nm左右。
 

 
三、悬浮细胞Hoechst染色步骤
1、离心收集细胞样品于1.5ml离心管内并弃液,加入Hoechst固定液0.5ml,缓缓悬起细胞,固定10min或更长时间(亦可4℃过夜)。
2、低速离心去除固定液,用PBS或生理盐水洗2次,每次3min。洗涤时手动晃动数次。
3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。
4、稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
5、滴加Hoechst33258染色液0.5ml,孵育5min。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。
6、弃染色液,用PBS或生理盐水洗2次,每次3min,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动。
7、滴一滴抗荧光封片剂于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
8、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右,发射波长460nm左右。
 

四、组织切片Hoechst染色步骤
1、常规包埋切片。
2、用PBS或生理盐水洗2次,每次3min。洗涤时手动晃动数次。
3、均匀滴上Hoechst33258染色液0.5ml,孵育5分钟。
4、弃染色液,用PBS或生理盐水洗2次,每次3min,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动。
5、 将切片置于载玻片上,滴一滴抗荧光封片剂,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
6、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右,发射波长460nm左右。

五、实验操作注意事项
1、荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽快检测。使用抗荧封片剂时也应避光操作。
2、在为了获得细胞沉淀的离心的过程中,对于特殊细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当提高离心力或延长离心时间。
3、Hoechst33258染色液对人体有一定刺激性,请注意适当防护。
 

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