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小管形成实验

一、小管形成实验介绍
1、原发性肿瘤以及继发性肿瘤,生长直径超过1~2 mm,都会有血管生成。肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。
 
2、BD采用专利技术,从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BD Matrigel 基底膜基质,其主要成分由层粘连蛋白,Ⅳ型胶原,巢蛋白,硫酸肝素糖蛋白等组成,还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。BD Matrigel基底膜基质在室温条件下,聚合形成具有生物学活性的三维基质,模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能,有利于体外细胞的培养和分化,以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
 
3、BD Matrigel 基底膜基质形成的三维培养基质,可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时,Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达,支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。
 
4、Matrigel基质会有色差变化(淡黄色到深红色),是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的,但是与5%CO2平衡后色差即会减少。冻融后,轻轻摇晃试剂瓶使Matrigel分散均匀。所有操作均需在无菌环境下进行,试剂瓶瓶盖可用70%乙醇擦拭,并自然干燥。应使用预冷的移液器以保证Matrigel呈匀浆状。
 
5、细胞可在0.5mm厚度的Matrigel基质层表面生长,也可在1mm厚度的Matrigel三维基质内生长。过度稀释的Matrigel会形成非胶质的蛋白层,可以用于细胞贴壁,但不能用于细胞的分化研究。
 
二、小管形成实验基本步骤
体外的血管生成实验能很好的模拟肿瘤的血管发生过程,并且适合研究药物对这一过程的影响实验。我们以HUVEC细胞为例,介绍这一实验的详细过程。
 

血管生成镜检图
 
1、 实验材料和实验方法
  1)实验材料,如下图:

  2)实验方法
   (1)实验流程介绍:提前将Matrigel融化,铺于ibidi血管生成载玻片的下孔中,待胶凝后,将细胞悬液加入血管生成载玻片上孔中,成管后使用显微镜观察。
 
实验流程图
 
   (2)耗材结构介绍:Matrigel铺在下孔,细胞铺在Matrigel上,上孔充满培养基
血管生成载玻片纵截面示意图
 
   (3)数据分析流程介绍:在特定的时间点采集图片,并且进行图像分析(Wimasis全自动分析)测量小管长度,成环数,细胞覆盖面积和结点。之后在对测量结果进行统计分析以说明实验结果。
实验结果收集和分析流程图
 
2、实验步骤
  1)准备基质胶
   (1)实验前一天将Matrigel置于冰盒中,放入4摄氏度冰箱,使胶能过夜缓慢融化。(注意:同样要准备一些4摄氏度预冷的枪头用于吸取Matrigel)
   (2)开始实验前,将Matrigel始终保持放在冰盒中。
   (3)打开灭菌包装,取出ibidi血管生成载玻片。
   (4)每孔中加入10μl Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能打入10μl的胶,却不能填满血管生成载玻片的下孔——这样,必然会影响到实验的成像结果。
 
 
    如何判断是否加入了合适体积的Matrigel:用一张格子纸就能知道自己的移液枪调整到多少能正好把下孔填满。
    如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。

  2)凝胶
   (1)盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
   (2)准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。
   (3)将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖上培养皿盖。
   (4)将整个培养皿放入培养箱中,静置30分钟左右,等待胶凝结。
   (5)等待同时准备细胞悬液。

 
  3)铺细胞加入细胞的量直接影响实验结果,所以在正式实验开始之前,要对不同类型的细胞和使用数量进行预实验。获得最佳比例的细胞密度。我们今天的实验使用HUVEC细胞,每孔种10000个细胞即可。
   (1)准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。
   (2)将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。
   (3)每孔加入50μl的细胞悬液,注意保持枪头垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。
   (4)同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液体正好加满。
   (5)盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。
 

 
  4)采集图像并统计结果可以按照细胞的生长速度定时采集图像,并且对其成管长度,覆盖面积,成环数,结点数进行测量和记录,并且对其进行统计分析。
 
  5)免疫荧光染色根据需要,可以对成管结果进行免疫荧光染色。
   (1)小心的移除上孔内培养基,注意不要碰到胶或者细胞网络。
   (2)加入50μl用无血清培养基稀释的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其终浓度为 6.25 µg/ml (1:160)。
   (3)在室温下避光孵育30分钟。
   (4)使用PBS清洗三次,注意,PBS要缓缓加入上孔,以免冲击掉细胞。
   (5)使用 485 nm/ 529 nm进行免疫荧光成像。
 
 
具体实验咨询,请联系嘉美实验
 

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