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流式细胞表型CD分子检测

 
一、嘉美实验流式细胞术CD分子检测
流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。FCM所有这些功能的实现依赖于一种特殊的仪器——流式细胞仪,它是综合了激光、电脑、流体力学、光学和荧光细胞学等先进技术的高科技产品。流式细胞主要是测量单个细胞经适当染色后所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。流式细胞术不仅可测量细胞的大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在细胞生物学、血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
 
白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)是白细胞(还包括血小板、血管内皮细胞等)在正常分化成熟不同谱系(lineage)和不同阶段以及活化过程中,出现或消失的细胞表面标记。流式细胞仪(Flow cytometer )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。通过检测CD分子的表达,可以研究免疫细胞的发育、某些免疫相关性疾病的发病机理和免疫病理状态,以及探讨采用免疫治疗的可能性。
 
二、单细胞悬液制备方法
流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上,制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。对不同来源和不同形式的样品,根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。
1、单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品,标本经过简单的制备悬液,离心分离处理,就可以得到分散较好的单个细胞悬液,是理想的流式细胞术检测对象。
2、对于不同组织来源的实体组织标本,采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。
3、石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用,从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液,去除碎片的单细胞悬液用70%乙醇固定保存。
 
三、检测细胞CD分子
当使用多种荧光抗体标记细胞时,直接标记的荧光抗体可以同时加入,而不必按顺序加入。下面的实验实例显示的是用三种荧光抗体同时标记 T 淋巴细胞亚群,这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行使用浓度滴定。
1、实验材料
  1)白细胞悬液(确定的细胞数量并经梯度纯化过)
  2)anti-CD3 藻红蛋白(PE)
  3)anti-CD8 荧光素(FITC)
  4)anti-CD4 CyChrome(Cy5)
  5)与特异性抗体蛋白浓度一致的 P E 、F IT C 、Cy5 标记的同型对照
  6)PBS,p H 7.2,  4℃平衡
  7)洗涤缓冲液(PBS+0. 1 % 叠 氮 钠 + 1 % 胎 牛 血 清 或 BSA) ,0. 22μm 滤 膜 过 滤 ,4℃平衡
  8)甲酵 [Polysciences,Warrington,PA ;cat.No.18814, 不含甲醇,16(质量分数)]
  9)时间:60〜90 min。
  10)特殊仪器:离心机、细胞计数装置、微量移液器( 移液体积精确到 10〜200W 和 1000mI)、流式细胞仪
 
 

2、操作步骤
  1) 收获或分离细胞,用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液,调整细胞浓度至 5X105细胞/ml。
  2) 在 每 个 12 mmX 75 mm 管 加 人 Im l 细胞悬液以用于以下染色:每种抗体(一抗和同型对照)的单染;三种抗体的同时染色;一管不加抗体的阴性对照。
  3) 1500 g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液 体 (约 100ul)。
  4) 按预先滴定量在每管中加人荧光标记的抗体或对照血清或同型对照。
  5) 振汤混勾,冰上避光放置 15 min。
  6) 加 人 Im l 冰冷 的 PBS。振荡混匀。
  7) 1500g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。
  8) 加 入 0.5 ml PBS 并振荡混匀。
  9) 加 人 0.5m l 甲醛固定液(2% ,体积分数)。避光保存于 4℃ 直到实验分析结束。
  10) 流式细胞仪每个样本检测 10000个门内细胞。
 
3、结果分析
图 中流式细胞数据以双参数直方图的形式表示,1 轴和 3;轴分别表示两个不同的激发光,2;轴表示细胞数量,用量化的点密度来描述。每个样本通 S f i t c 对 照 PE、 PE对 照 CyChrome 和 FITC 对 照 CyChrome 来分析。单色标记的样本用来确定荧光存在于预期细胞群,并能调整存在于其他色轴此颜色信号的电子补偿。同型对照或未标记样本直方图中的资料能用来获得阴性和阳性分析门,这 样 99% 的 阴 性 细 胞 落 在 阴 性 门 中 ,<1% 的细胞落在阳性门中。注 意 与 x 轴 和 3;轴交叉的两条线,它们划分出了落在每个象限的细胞数量。最下面的三幅图显示了只表达三种抗原表位中的一种的细胞(左上象限或右下象限)和表达其中两种抗原表位的细胞(右上象限)

 
三、流式细胞术实验服务流程
 
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