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流式分选技术服务

一、流式分选原理介绍
流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉;某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。
 
二、流式细胞分选样本制备
制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
 
1、用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10^6~1×10^7/ml
 
2、取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清,4℃ 30min,用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min
 
3、弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇,4℃ 30min,用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右1000rpm×5min
 
4、加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,视细胞浓度加入100~500μl固定液)
 
5、FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5~7天)
 

 
三、流式细胞分选的特点
1、少量细胞分选时,流式细胞分选精确度高(99%以上),速度快。目前,先进的流式细胞仪的分选速度可达25000个细胞/秒以上,比传统的分选速度提高了很多倍,原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制,一次分离的最大合理量约为10^8个细胞。如果细胞量超过10^9个,则需要耗费10小时以上,分选后细胞的活力会受到很大的影响。

2、可以同时进行多个Marker分选,正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷,因此在电场中只能向左或向右偏转,即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量,从而调整液滴的偏转角度,实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。

3、不仅仅限于表面抗原,流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度(如细胞体积)或荧光(如DNA、RNA或蛋白含量,酶活性,特异抗原)散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态,那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。
 
4、如果只是偶尔做几次细胞分选的话,用流式分选还是比较划算的,不需要购买配套的设备。

四、流式细胞分选注意事项
1、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。

3、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。

4、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
 

五、流式分选服务项目
1、普通细胞分选(稳定表达细胞株的筛选)
 
2、单克隆细胞分选
 
3、成分分选(淋巴细胞亚群分选,肝脏非实质细胞的分选等)
 
4、干/祖细胞分选
 
5、染色体分选
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