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抗氧化/自由基检测



 
在抗氧化研究中,自由基的检测已成为至关重要的一环,得到了广泛的应用。自由基,化学上也称为“游离基”,是指化合物的分子在光热等外界条件下,共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。自由基检测的方法多种多样,包括自由基相关酶的测定,化学发光测定,吸光度法等。抗氧化活性的检测方法与被测物的性质、组成和检测体系等因素密切相关。抗氧化活性的检测模式主要有:1.测量底物(标记底物)或产物的量的变化;2.测量氧化反应的速率;3.测量特征自由基变化的速度或程度;4.测量被测物的抑制率;5.测量被测物产生与标准抗氧化剂同等作用的浓度。

一、对超氧阴离子的清除作用
1、利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L-1的Tris-HCI缓冲液3 mL (pH=8.2,含有2 mmol·L-1的Na2EDTA),加入l mL待检样品,于25℃保温10 min,然后加入25 ℃预温的5 mmol·L-1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L-1的盐酸配制),精确反应4 min,用0.5 mL浓盐酸终止反应,测定其在320 nm下的吸光度。以10 mmol·L-1的盐酸作为空白调零,按如下公式计算清除率: 
式中A对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度(用1mL 10 mmol·L-1的盐酸替代样品);A样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度;A样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度(用0.3mL 10 mmol·L-1的盐酸替代邻苯三酚溶液)。  

2、注意事项
  1)
所用的两个比色皿杯子必须是石英的,上面会写着“Q”,或“S”,不得使用玻璃的,玻璃比色皿要么什么都不写,要么写着 “G”。 
  2)测定前要用100g砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准,要求误差不超过5‰,不是5%。 
  3)测定大量数据前,使用者先配制10g/L的Vc,做三个平行测定,精准度达到5%以内再开始正确的测定。
  4)测定时由于每个人有使用习惯和误差,中间不得换人换枪。

二、对DPPH·的清除作用 
1、样品遇酒精不浑浊的操作
DPPH·溶液的配制:取待检样品l mL与120μmol·L-1的DPPH·溶液3 mL加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30 min,以无水乙醇为空白,在517 nm下测定其吸光度,并按下式计算清除率:
式中A对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL无水乙醇补充体积);A 样品 为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度;A 样品空白 为加入待检 样品后的无DPPH·的反应体系的吸光度(用3mL无水乙醇补充体积)。

注意事项:实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的,但是两个比色皿要一致。石英的,上面会写着“Q”,或“S”;玻璃比色皿要么什么都不写,要么写着 “G”。 准确称取47 mg DPPH·,用无水乙醇溶解并定容至100 mL,避光保存(0~4℃),使用时稀释至120 μmol·L-1。

2、样品遇到酒精大量浑浊的操作
DPPH·溶液的配制:准确称取47 mg DPPH·,用无水乙醇溶解并定容至100 mL,避光保存(0~4℃),使用时稀释至120 μmol·L-1。取待检样品l mL与120μmol·L-1的DPPH·溶液3 mL加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30 min,以纯水为空白,在517 nm下测定其吸光度,并按下式计算清除率:
式中A对照 为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL纯水补充体 积);A 样品 为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度;A样品空白 为加入待检样 品后的无DPPH·的反应体系的吸光度(用3mL纯水补充体积)。

三、对羟自由基的清除作用
利用H2O2与Fe2+混合产生•OH,在体系中加入水杨酸捕捉•OH并产生有色物质,该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H2O2 1mL、9mmol/L FeSO4 1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL,不同浓度的样品溶液1mL。最后加H2O2启动反应,37℃反应30min,以蒸馏水为参比,在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值,以9mmol/L FeSO4 1mL、9mmol/L 水杨酸-乙醇溶液1mL,不同浓度的样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值。按下式计算•OH清除率:
A0—空白对照液的吸光度; 
Ax—加入样品溶液后的吸光度; 
Ax0—不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度。

四、总还原能力的测定
在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度(2,4,6,8mg/mL)的溶液1mL,加入2.5 mL 1%铁氰化钾,混合均匀后于50℃反应20min。取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应,5000r/min离心10min。取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸馏水和0.5mL FeCl3,混匀后静置10min,在700nm处检测吸光值。Vc作为阳性对照。 

五、对Fe2+离子螯合能力的测定
分别取1mL不同浓度(2,4,6,8mg/mL)的溶液和3.7mL蒸馏水,加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL,25℃水浴10min,于562nm处测吸光值。EDTA为阳性对照。样品对Fe2+的螯合率计算公式如下:
A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值; 
A1—样品溶液反应后的吸光值; 
A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。

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