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凋亡因子Caspase系列检测



一、Caspase 家族及其在细胞凋亡中的作用
Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase),是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶,与真核细胞凋亡密切相关,并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。Caspase是一类蛋白酶家族,根据其蛋白酶序列的同源性可分为3个亚族:Caspase-1亚族包括 Caspase-1、4、5、11;Caspase-2亚族包括Caspase-2、9; Caspase-3亚族包括Caspase-3、6、7、8、10。起细胞凋亡执行作用的是caspase-3、6、7。Caspase又分为起始者(initiators)和执行者(executioners)两类,起始Caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活,激活的起始Caspase对执行者Caspase进行切割并使之激活,被激活的执行者Caspase通过对caspase靶蛋白的水解,导致程序性细胞死亡。
 
1、凋亡起始者:Caspase 9、8、2、10、11;同性活化——切割自身前体
 
2、凋亡执行者:Caspase 3、6、7;异性活化——切割结构蛋白、功能蛋白
 
二、Caspase的检测
嘉美实验有多年的检测caspase系列酶的经验。下面以检测caspase-3酶活性为例,介绍caspase的检测。

1、检测原理
半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原(32KDa)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KDa)和两个小亚基(12KDa)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。活化的Caspase-3可以剪切特定的氨基酸序列。嘉美实验用具有高度特异性Caspase-3荧光底物用来检测Caspase-3 活性。在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA  (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.

2、实验前准备
消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计

3、活性测定操作步骤
  1)每组试剂组成 

共需 2×Reaction buffer 810 ul,配制2×830ul以防不够,用前加入8.3ul DTT
活性表示为=样本OD1-背景OD1(实验组)/样本OD2-背景OD2(对照组)
 
  2)操作步骤
   (1)从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织(已称重标记好的),取2-3块(30mg/块),放在EP管中,一直浸在冰水中。
   (2)锡铂纸剥去,组织直接置于EP管中,加裂解buffer(溶后4摄氏度保存)约700ul;冰上EP管中,用小弯剪将心脏组织剪碎,越碎越好;组织、裂解buffer比例:1:10;冰上操作。
   (3)开匀浆机:取几块冰块于小烧杯中,接自来水成冰水液;将EP管置于盛有冰水的小烧杯中,固定于匀浆机上;先做对照组;将转头插于组织液面下,打开电源,逐渐调大速度至max,上下搅动,直至浑浊,基本无小的组织块为止;调小速度至零,关电源,取出转头,EP管放回冰水底座
用蒸馏水冲洗转头,液冲至废烧杯中;依次以同样方法将样本组进行匀浆。注意:放空转,慢慢加速,别转别上下移动轴。
   (4)匀浆后置于离心机内:先设时间10min,“起动”;缓慢增大离心速度至1000×10r/min;缓慢减小离心速度,降至30×10r/min时,“停机”灯亮,即可取出;注配平:套管A、B、C、D配平。
   (5)取Reaction buffer 6ml,用前加入60ul DTT(稀释100倍);吸取上清至小EP管;依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板,加底物时,每加一次换一个枪头(因为要混匀);注:底物每取完一次都要盖盖,避光; 加完底物后,混匀。
   (6)水浴箱中孵育90min。
   (7)预热酶标仪30min(提前半小时打开酶标仪)。
   (8)酶标仪上读取OD值(405nm处测)。
 
  3)测蛋白
   (1)
需准备考马斯亮兰试剂盒
   (2)用剩余的血清测蛋白
   (3)样本管:每管2.1ml考马斯亮兰+35ul血清   (考马斯亮兰原液5ul,5倍稀释);空白管:2.1ml考马斯亮兰。
   (4)开盖调零,关盖调百,595nm处测定

  4)注意事项
   (1)
提前计算所需Reaction buffer的量,然后用前加入DTT(稀释100倍)。
   (2)DEVD-pNA要避光保存。
 
具体实验咨询,请联系嘉美实验。

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