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PKC蛋白激酶活性检测

 


实验试剂:琼脂糖(Promega公司,V3125);其他常备试剂购自sigma公司;PKC活性检测试剂盒(Promega公司, V5330)
实验仪器:电泳仪(北京六一厂,112-0640);水平电泳槽(北京六一厂,122-3146);电热恒温培养箱(碧云天生物,EBI025);电热恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂,HH-8)
基本原理:分离PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白),利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分,利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白,利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较,以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性(PKC活化度)。

操作步骤:
1.
用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2.在4℃,用14,000 × g 离心裂解液5 分钟,保存上清。
3.用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱,再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子,然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4.用PKC 稀释液(PKC dilution buffer)将少量蛋白激酶C(Promtein Kinase C)稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5.用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒,或直到溶液变温暖。
6.对每一个样品,按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide,超声过的PKC Activator 5X Solution,和水。在样品加入之前,小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值(说明书第IV.部分)。

标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer,5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul),5ul
PKC Activator 5X Solution, 超声处理的,5ul
短肽保护液(非必须),1ul
样品, 9ul
去离子水使终体积为,25ul

PKC阳性对照检测 
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer,5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul)  ,5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的,5ul
短肽保护液(非必须),1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer),4ul
去离子水使终体积为,25ul

PKC阴性对照检测(不加PKC)
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer,5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) ,5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的,5ul
短肽保护液(非必须),1ul
去离子水使终体积为,25ul

7.在0 时间点,把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃ 再孵育30 分钟。
8.把管子放进开水浴或95℃ 加热块10 分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃ 或-20℃。
9.把样品上样到胶上之前,往每个样品中加进1ul 的80%甘油,以确保样品保留在上样孔中(说明书第III.F 部分)。
10.每孔点样10ul,在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品,拍照。

检测结果:
说明:后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。
注:阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比
(以阳性对照IOD值为100,其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值)



 
Lanes: Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 Lane 5 Lane 6 Lane PC
Rows ( % ) ( % ) ( % ) ( % ) ( % ) ( % ) ( % )
PKC 77.082 75.616 88.98 66.975 77.93 74.645 100
p-PKC 22.918 24.384 11.02 33.025 22.07 25.355 0
Sum 100 100 100 100 100 100 100
p-PKC:PKC 0.29732 0.322471 0.123848 0.493094 0.283203 0.339674 0
样本 #1 #2 #3 #4 #5 #6 PC
 

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