Hi,欢迎来到嘉美实验中心
公司文化|联系我们

lab-manager@jiamay.com400-000-7401

(扫一扫关注我们)

联系我们

电 话:400-000-7401

邮 箱:lab-manager@jiamay.com

地 址:北京市昌平区中东路5号院4号楼1809

邮 编:100012

您当前所在的位置:首页 > 服务项目 > 免疫生化实验 > CBA多因子检测

CBA多因子检测


一、CBA流式多因子检测原理介绍
CBA(Cytometric Bead Array)技术是基于包被抗体的微球并利用流式细胞仪同时对多种蛋白质进行定量分析的创新性技术。它是一系列不同荧光强度、各自包被不同捕获抗体的微球,在同一反应中与少量样本混合孵育来捕获相应抗原,再与带荧光标记的第二种抗体以双抗夹心的结合方式,用流式细胞仪来检测区别不同微球,再分析每个微球上的定量抗原的荧光素强度,根据已知浓度的标准蛋白和对应的荧光强度绘制标准曲线,来拟合计算未知样本中的相应抗原浓度。

Cytometric Bead Array(CBA),即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法,它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性,将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上,即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。 CBA的基本原理近似于ELISA的检测,即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物,并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光,从而测定待测物的数量。

每个CBA微球大小一致,具有特定的荧光强度,包被有适用于特定分析(如其它抗体或者可溶性蛋白)的特异性捕获抗体(Capture Antibody),提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后,微球上的特异性抗体就与样品(血清、血浆或者细胞培养液)中相应的抗原或蛋白结合,然后加入荧光标记的检测抗体,就会形成“三明治”夹心复合物。最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光,在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性;检测抗体带有PE荧光素标记,在流式细胞仪的FL2通道检测,通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。
 

二、CBA技术特点
CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面,捕获微球与待测样品后,呈悬浮态,与ELISA相比,能更有效地捕获被分析物;CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点,对样本需求量更少,检测更快速、更准确。CBA主要的技术特点:
1、轻松实现多重检测。最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。
2、样本需要量小。仅需要50μL溶液就可进行一次检测。
3、更高的灵敏度。分析灵敏度高达2.8pg/mL。
4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml,所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量,排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。
5、检测对象的灵活组合—BD CBA Flex Set。CBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标,形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣,BD于2005年初推出了CBA Flex set。它改变了CBAkit的固定形式,成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标,最多能同时检测75个指标。除了拥有CBA kit的优势外,Flex Set还配有独立的软件分析系统(CBA Flex Set Analysis Software),并且可以在BD FACSArray Bioanalyzer上,直接用96孔和384孔板进行操作。CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由,更大的选择空间,而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。
6、操作简单,省时省力。CBA技术采用芯片式集成测定,所有检测只需一组标准曲线,就可计算出每种待测蛋白浓度;操作简单,整个流程只需要3.5小时,对待测样本可做实时分析,缩短检测了时间,提高了检测效率。
7、强大的软件分析系统。BD CBA软件具有强大的数据处理能力,直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度;除了为用户提供待测物的计数结果外,还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。和传统的液相蛋白定量技术相比,CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。CBA应用:自CBA上市以来,越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析,系统性红斑狼疮(SLE)和新生儿脓血症等免疫疾病的监控,肿瘤研究,药物对病人的治疗效果评估,药物研发,疫苗研究,总体免疫功能分析等多领域。革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点:

检测优点:(与ELISA相比)
1、所需要的样本量小:所有的指标同时检测最多只需50ul样本。
2、节省检测时间和工作量:所有指标同时检测只需一个流程,操作简便,有自动分析软件处理数据。
3、同时检测的目的蛋白多,选择自由度大:实际检测中可同时自由组合30个指标,可将感兴趣的指标都加进去。
传统ELISA 流式CBA检测技术
单项检测 多参数检测
每项实验样本用量50-200ul 样本用量少于50ul
需要抗原包被 操作方便,节省时间
实验时间大于24h 流式细胞仪自动检测,标准曲线自动测定,专用软件自动计算
酶-底物背景干扰 无酶-底物背景干扰
 



 
三、CBA的应用
自CBA技术问世以来,越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析,系统性红斑狼疮(SLE)和新生儿脓血症等免疫疾病的监控,肿瘤研究,药物对病人的治疗效果评估,药物研发,疫苗研究,总体免疫功能分析等多领域。

四、CBA检测指标
1、CBA细胞因子检测指标
目录号 产品说明 检测指标
557800 Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-γ
560485 Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10
551287 Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ,TNF
552364 Mouse Inflammation Kit IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70
550026 Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit Heavy and light chain isotypes of mouse IgG1,IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, and IgE
560484 Human Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A
550749 Human Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g
551809 Human Th1/Th2 Cytokine Kit II IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g
551811 Human Inflammatory Cytokine Kit IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70
552990 Human Chemokine Kit IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10
561418 Human Anaphylatoxin Kit C3A,C4A,C5A
 
2、CBA Flex Set 细胞因子检测指标
Human  Mouse  Rat
 IFN-γ,INF-α
 IL-1 α ,IL-1β,   
 IL-2,IL-3,
 IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7,
 IL-8, IL-9, IL-10,   
 IL-11,IL-12, IL-12p70, 
 IL-13,IL-17A, IL-21, 
 IL-23p40
 TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ
 IP-10
 I-TAC
 MIG
 MCP-1
 MIP-1 α, MIP-1 β
 Eotaxin
 RANTES
 CD54(ICAM-1)
 CD62E,CD62P,CD62L
 CD106(VCAM-1)
 sCD40
 sCD154
 sCD121a,sCD121b
 Soluble CD14
 Basic FGF
 VEGF
 Angiogenin
 G-CSF,GM-CSF
 LIF
 LT-α
 OSM
 Granzyme A, 
 Granzyme B
 Fas Ligand(FasL)
 Fractalkine
 IgA, IgG1, IgG2,  
 IgG3,IgG4, IgM, 
  Total IgG,
 IFN- γ
 IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3,
 IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9,
 IL-10, IL-12, IL-12p70,
 IL-13, IL-17A, IL-21, 
 IL-23p40,
 TNF
 MIG
 MCP-1
 MIP-1 α, MIP-1 β
 RANTES
 KC
 CD62E(E-Selectin),
 CD62L(L-Selectin)
 G-CSF,GM-CSF
 IFN- γ
 IL-1 α, IL-4 , IL-6,
 IL-10
 TNF

3、CBA Flex Set 信号转导指标
 Phospho Akt1(S473)  Phospho Akt2(S474)
 Phospho BLNK (Y84)  Phospho p120 Catenin(Y228)
 Phospho Btk (Y551)  Phospho MEK1/2(S222)
 Phospho eNOS (S1177)  Phospho Paxillin(Y118)
 Phospho ERK1/2 (T202/Y204)  Phospho Pyk2(Y402)
 Phospho Itk (Y511)  Phospho SLP-76(Y145)
 Phospho JNK1/2 (T183/Y185)  Phospho c-jun(S63)
 Phospho p38 (T180/Y182)  Phospho stat3
 Phospho PLCg (Y783)  Total Stat1
 Phospho Rsk (T573)  Total Syk
 Phospho Stat1 (Y701)  Total ZAP70
 Phospho Syk (Y352)  Phospho ZAP70 (Y319)
 
4、CBA Flex Set 干细胞指标
Human Rex-1 Flex Set
Human Oct-4 Flex Set
Human Nanog Flex Set


 
 
五、样本准备部分常见问题:实验过程中,客户只需要提供血清等标本。以下问题为具体操作问题,客户可以了解,不需要掌握。
1.Q:实验过程中,除了CBA的分析试剂盒,我们还需要准备什么? 
A:除了试剂盒中所包含的成份外,若要进行CBA分析实验,还需要流式液相多重蛋白定量技术分析软件,此软件主要是用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用CBA的特定软件,但是,由于CBA实验中所采集的数据较为繁杂,若不通过专用的CBA软件进行分析,则进行数据分析的时间将显着增加。此外,用户还需要至少有一个488纳米激光器及3个荧光参数的接收的流式细胞仪。
 
2.Q:CBA中使用的微球是由什么做的?所使用到的微球的平均半径是多少? 
A:CBA中使用的微球的原料是聚苯乙烯,约为7.5um。
 
3.Q:在CBA分析中我应该使用何种型号的试验管? 
A:除了FACSArray外, 我们建议使用12x75 mm, 5 ml的聚苯乙烯管(BD Falcon Cat No. 352008)。
 
4.Q:样本制备管的选择需注意什么? 
A:推荐用聚丙烯管制备样本,不要用玻璃管或器皿。玻璃容器可导致检测信号减低,得出错误的结果。
 
5.Q:CBA分析中在进行标准曲线的配制时,有什么需要特别注意的地方? 
A:CBA试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉,由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白,在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时,不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品,在重悬标准样品成溶液时,在加入溶液后,只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时,只需轻轻吹打样品数次即可。否则,由于制成溶液后的标准样品不稳定,经剧烈混匀后易降解失活,影响实验中标准曲线的拟制。
 
6.Q:是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品? 
A:标准品在配成溶液后不稳定,在配制成溶液的12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液。
 
7.Q:为什么振动混合捕获微球这个实验步骤如此关键? 
A:在使用之前,捕获微球必须充分的振动混合,从微球混合液试管中分到每一个实验管之前,直至在送到仪器进行上样检测之前,反应管都必须充分振动混合,这是由于充分的振动能够防止微球聚集成团。若混合不足会导致在进行样品分析时候出现检测到很少或者没有检测到微球的情况。因此在使用流式细胞仪分析标准品或者样品之前,必须充分振荡混合微球。试验管在放置到流式细胞仪上检测前需要振荡混合3-5秒钟,这样在FL3通道里面能够更好的分辨出带有不同标志的微球。
 
8.Q:CBA操作实验中,哪些步骤需要避光进行?为什么? 
A:凡涉及检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是由于CBA技术是使用藻红蛋白检测样品的荧光信号。由于使用藻红蛋白报告系统,可使得CBA达到最佳敏感度的分析效果,因此每步添加了检测试剂后都要避光反应。此外,在加入检测试剂时,除了需避光操作外,还需严格遵守试剂盒的要求规范操作(比如:精确的加液),因为添加的微球数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测的敏感性。
 
9.Q:生物危害性样本怎么处理? 
A:上流式细胞仪分析样本之前,可用1%的多聚甲醛短暂固定。然而,这可能影响实验结果,需操作者验证。
 
六.上机检测部分常见问题:实验过程中,客户只需要提供血清等标本。以下问题为具体操作问题,客户可以了解,不需要掌握。
1.Q:我看不到FL2荧光信号或者看到的FL2荧光信号很弱,怎样解决这个问题? 
A:检查样品的稀释度,不要随意的更改要求的孵育时间,在孵育过程中,保护样品试剂管不受到光照。
 
2.Q:实验中,在检测的时候发现微球聚集在一起,这是什么原因? 
A:这可能是因为样品中的细胞因子的浓度太高了。此外,在实验前,请按试剂盒上的操作说明对流式细胞仪上各荧光补偿进行仔细调节,以确保所使用流式细胞仪参数是对应于CBA操作的最优化设定。
 
3.Q:为什么在实验中我的实验结果背景很强/或者全部样品都显示高度的阳性? 
A:实验结果背景很强可能是因为样品的浓度太高。请对您的样品,尤其是首次进行检测的体系,进行不同稀释度的检测。如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数,这时候请对您的样品进行进一步的稀释,因为您的样品的浓度已高于本系统的正常检测范围。
 
4.Q:为什么在实验中会出现碎片过多和没有看到微球的情况? 
A:如果在样品分析的时候在FSC/SSC的检测图中出现碎片,上调SSC的阈值或者同时上调FSC和SSC的双阈值。如果在调整SSC的阈值以后问题依然存在,请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。
 
5.Q:FL3直方图中, 有一种微球数量很低,为什么? 
A:在使用之前,每种微球必须充分的涡旋混合,从在微球混合液试管中加入另外一试管之前,在送到仪器进行上样检测之前,反应管都必须充分振动混合,如果没有充分涡旋,尤其将各种微球混合之前没有充分涡旋就有可能丢失微球。
 
6.Q:样本重复性检测结果波动大,为什么? 
A:捕获微球易聚集,在吸取之前要充分混匀。
 
7.Q:样本中所含微球数目过低,为什么? 
A:在洗涤步骤中去上清时,避免吸出微球。在洗涤或重悬时,液体体积不要高于推荐所用体积。
 
8.Q:样本中几乎检测不到蛋白,为什么? 
A:样本稀释浓度可能过低。尝试不同稀释浓度的样本。选取合适的样本或合适时间点的样本。
 
9.Q:获取时微球群的FL3通道荧光有重叠,为什么? 
A:某些含有非常高浓度细胞因子的样本可能发生此种情况。确保用setup微球优化仪器条件。
 
七.结果分析部分常见问题:实验过程中,客户只需要提供血清等标本。以下问题为具体操作问题,客户可以了解,不需要掌握。
1.Q:软件在做标准曲线时报错,为什么? 
A:软件安装问题。 用户需要完全安装MS Excel 2003,并安装CBA add-in。
 
2.Q:标准曲线不理想,原因是什么? 
A:1)CBA试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉,由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白,在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时,不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品,在重悬标准样品成溶液时,在加入溶液后,只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时,只需轻轻吹打样品数次即可。否则,由于制成溶液后的标准样品不稳定,经剧烈混匀后易降解失活,影响实验中标准曲线的拟制; 
2)不管是标准品储备液(x10)或实验中的稀释液中,标准品在配成溶液后不稳定,在配制成储备液(x10) 的12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液; 
3)在加入检测试剂时,需严格遵守试剂盒的要求规范操作(比如:精确的加液),因为添加的微球数量不准确会改变有效捕获面积, 从而影响检测的敏感性和准确性。
 
3.Q:分析时不能自动读取数据的MFI,为什么? 
A:1)FSC/SSC中碎片太多. 应注意维护仪器正常状态, FACSComp Lyse/ No Wash Pass;
2)FL3和/或FL4分辨率差,不能区分不同微球。 应注意维护仪器正常状态, FACSComp Lyse/No Wash Pass。
 
4.Q:标准品和/或样本MFI过低的原因是什么? 
A:1) 反应温度低; 
2) 反应时间短; 
3) 样本过度稀释; 
4) 操作过程中未避光;
 
5.Q:CBA的检测结果是否可直接与ELISA的分析结果进行对比? 
A:不可以。因为CBA是基于荧光的报告系统实现的,虽然CBA系统相对于ELISA分析具有良好的优势,能够提供更高的敏感性和更大的浓度检测范围。但是两者得出的实验数据不能够直接比较,需对CBA的数据通过和已有的ELISA数据进行校正,得到两者的相关性结果。
 
6.Q:在血清和血浆中,CBA试剂盒所能够检测到的最低浓度是多少? 
A:我们不建议研究者根据标准曲线外推低于标准曲线最低值的实验报告数值。这样的外推操作会增加结果的数学统计学上的变化程度和导致标准差值的增大。最理想的情况是我们做标准曲线的时候增加额外的稀释浓度点(比如10, 5, 2.5, 1.25 pg/ml)。当一些蛋白相对于背景(0 pg/ml)没有信号的情况下,我们就可以在最后的样品分析中把这种蛋白排除掉。在常规的免疫分析中,血清和血浆中的一些细胞因子的含量低于检测的最低值以至于不能被检测到。这是因为绝大部分的细胞因子在具有特殊的免疫活性的位点附近起作用,它们的作用效率很高,在许多情况下它们的半衰期很短,而且它们在许多种类型的细胞上都起作用。但是,我们可以推测只有在异常的情况下,它们在系统液体例如血清和血浆中的含量的测定值才会很高。一些作用范围很广的蛋白例如细胞趋化因子、激素、生长因子等在血清和血浆中的含量很高,半衰期很长和很容易检测到的情况是不多见的。
 
更多的实验服务及产品技术咨询,请联系嘉美实验

© 2017 北京嘉美臻元生物技术有限公司 保留所有权利 京ICP备10216606号-3