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原位杂交(ISH/FISH)实验


一、实验技术简介
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
 
二、实验技术原理
用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
 
三、实验操作流程
1、探针变性:将探针在75℃怛温水浴中温育5min,立即置0℃,5~10min,使双链DNA探针变性。
 
2、标本变性:
  1)将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2~3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。
  2)取出玻片标本,将其浸在70~75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2~3min。
  3)立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水,每次5min,然后空气干燥。
 
3、杂交:将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上,盖上18×18盖玻片,用Parafilm封片,置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜(约15~17h)。由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续时间又长,因此为了保持标本的湿润状态,此过程在湿盒中进行。
 
4、洗脱:此步骤有助于除去非特异性结合的探针,从而降低本底。
  1)杂交次日,将标本从37℃温箱中取出,用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
  2)将已杂交的玻片标本放置于已预热42~50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次,每次5min。
  3)在已预热42~50℃的1×SSC中洗涤3次,每次5min。
  4)在室温下,将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
 
5、杂交信号的放大
  1)在玻片的杂交部位加150mL封闭液I,用保鲜膜覆盖,37℃温育20min。
  2)去掉保鲜膜,再加150mL avidin-FITC于标本上,用保鲜膜覆盖,37℃继续温育40min。
  3)取出标本,将其放入已预热42~50℃的洗脱液中洗涤3次,每次5min。
  4)在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II,覆盖保鲜膜,37℃温育20min。
  5)去掉保鲜膜,加150mL antiavidin于标本上,覆盖新的保鲜膜,37℃温育40min。
  6)取出标本,将其放入已预热42~50℃的新洗脱液中,洗涤3次,每次5min。
  7)重复步骤(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室温清洗一下。
  8)取出玻片,自然干燥。
  9)取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上,盖上盖玻片。
 
6、封片:可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用),为防止盖片与载片之间的溶液挥发,可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20~-80℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
 
7、荧光显微镜观察FISH结果:先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野,然后打开荧光激发光源,FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色,而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。
 

 
四、样品要求
样品制备无特殊要求;各种染色、非染色、荧光标记的组织(包括活组织)、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。
1、石蜡切片
取材:1、组织离体后需及时固定;2、组织标本不宜过大、过厚。
固定:1、固定液:10%福尔马林(4%多聚甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1~20:1;3、固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。

2、冰冻切片
取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。
保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。

3、细胞块石蜡切片
细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

4、细胞爬片
在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。

5、细胞涂片
细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋酸液、乙醚-酒精液和Carney’s液等。 
 

 
五、其他及注意事项
1、配制时应在通风条件下操作,并避免接触皮肤和吸入(戴手套及口罩),因PFA有较强的固定作用及毒性,对粘膜及皮肤有固定及毒性,刺激作用;
2、加热时,温度不宜过高,常为60~65℃,否则,PFA降解失效;
3、配制好的PFA虽可存放一定时间,但过久的液体,固定效果下降,应尽早使用。
4、4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液,它能较好地保持组织及细胞内的RNA,同时对形态保持也较好。样品固定时间在2~3小时,RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联,影响探针的穿透力,降低杂交效率。

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