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核仁组成区嗜银(AgNOR)染色

 

一、核仁组成区嗜银(AGNOR)染色简介
核仁组成区(NORs)是染色体上的一个编码核糖体RNA(rRNA)的片段,存在于DNA特异性环上,凸向核仁。在电镜下,核仁组成区为在电子致密区中的境界不清的浅染区域。在石蜡切片上,在核仁中见到的每一个点状反应颗粒有可能代表多个AgNOR位点。核仁组成区嗜银蛋白染色主要特点是操作简便、批量染色的较为经济,AgNOR位点的数量增加与细胞增殖性增加有关,对于良恶性肿瘤的鉴别具有一定的意义。

二、试剂配制
1、AgNOR染色液
甲液:明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml,在60℃使之完全溶解,再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。
乙液:硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml,4℃冰箱保存。
2、AgNOR工作液
取甲液10 ml,乙液20 ml 临用前混合。
 
三、染色步骤
1.切片脱蜡至水
2.双蒸水洗2次
3.AgNOR 工作液中(25℃)浸染30分钟(暗处进行)(镜下观察)
4.脱水,透明,封固
5.结果:油镜观察,细胞核及胞质背景为淡黄色, AgNOR呈棕黑色颗粒状。


四、样本说明
1、石蜡切片
取材:1、组织离体后需及时固定;2、组织标本不宜过大、过厚。
固定:1、固定液:10%福尔马林(4%多聚甲醛)或10%中性甲醛;2、用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1~20:1;3、固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。
 
2、冰冻切片
取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。
保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。
 
3、细胞块石蜡切片
细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。
 
4、细胞爬片
在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。
 
5、细胞涂片细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋酸液、乙醚-酒精液和Carney’s液等。 
 
五、注意事项
1、常用的固定液为中性甲醛和4%多聚甲醛,能使大多数抗原保存良好,适用于免疫组织化学。
2、病理实验切片最好是防脱片,以免实验过程中出现掉片。若客户提供切片,应告知切片有无防脱处理。
3、骨组织、皮肤组织或脂肪含量较高的样本,实验过程中有较高的掉片几率。
4、客户可提供组织块(以10%福尔马林、4%多聚甲醛或10%中性甲醛固定,如组织块极小请事先说明)、蜡块或切片(使用免疫组化专用切片,以避免实验过程中掉片)
5、待检测蛋白的种属、实验分组情况及实验背景资料、其他具体要求等需事先说明。
6、若客户提供骨组织或钙化程度较高的组织进行实验,需进行脱钙处理。
7、浸泡在固定液中的组织样本,在运输中容器需密封,防止破碎、渗漏。

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