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TUNEL组织细胞凋亡实验


嘉美实验Tunel特色实验介绍

一、实验委托者只需要提供:组织、蜡块、切片,任意一种标本即可
二、嘉美实验可以提供:Tunel凋亡检测试剂盒及其相关的所有试剂、耗材


 
一、TUNEL组织细胞凋亡实验简介
TUNEL技术,即脱氧核苷酸末端转移酶( Terminal deoxynucleo tidyl transferase,TdT )介导的dUTP缺口末端标记(TdT mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL ) 技术是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法。细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测

二、检测步骤
1、脱蜡至水。脱蜡可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯两次 5-10 min;水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀
2、PBS漂洗
3、蛋白酶K消化
4、灭活内源性过氧化酶物
5、生物素标记
6、孵育Streptavidin-HRP
7、底物与DAB反应显色
8、脱水、透明、封片
9、显微镜观察、照相
 
三、样本说明
1、石蜡切片
取材:1)组织离体后需及时固定;2)组织标本不宜过大、过厚。
固定:1)固定液:10%福尔马林(4%多聚甲醛)或10%中性甲醛;2)用量:一般固定液的量与组织体积比为10:1~20:1;3)固定:适宜的固定时间,主要根据材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。
保存:切片经60℃烤片3-5小时后,可于常温或4℃干燥保存。

2、冰冻切片
取材:取材后需立即置于超低温冰箱或液氮中保存。
固定:样本冰冻切片后,应立即放入甲醇、丙酮、95%酒精、4%多聚甲醛等固定液中固定。
保存:固定好的切片自然风干,密封后置于-80℃、-20℃保存,尽快用于后续实验。

3、细胞块石蜡切片
细胞量较多的样品,可离心分离所需细胞,用中性甲醛固定后制作成琼脂细胞块,然后按照制作石蜡切片的操作流程进行切片。

4、细胞爬片
在孔板里做的细胞爬片,爬片取出后,用PBS洗涤2次(根据研究目的,PBS洗涤可选择不做),用4%多聚甲醛4℃固定15分钟,将表面液体吹干,置于-20℃保存。若在短时间内即开展实验,可在加固定液后,于4℃冰箱中放置一段时间。

5、细胞涂片
细胞涂片常用的固定液有95%酒精(最为常用)、酒精-冰醋酸液、乙醚-酒精液和Carney’s液等。 

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